[发明专利]甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物

说明书

技术领域

本发明涉及甲型副伤寒沙门菌的检测，具体地说，涉及甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物。

背景技术

甲型副伤寒沙门菌(S.Paratyphi A)是肠道传染病中最常见的病原菌之一，对甲型副伤寒沙门菌的快速、准确检定是控制甲型副伤寒流行的重要手段。目前实验室常规诊断甲型副伤寒的主要方法为细菌培养、肥达氏凝集反应、伤寒血球快速诊断方法。这些方法仍存在着阳性率相对较低，诱导H-a抗原费时，不利于早期诊断等缺陷，给流行病学追踪、早期控制及临床早期诊断工作带来一定难度，因此，有必要建立甲型副伤寒沙门菌的快速、准确的分子生物学检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物。

本发明的另一目的是提供含有所述逆转录荧光PCR引物的用于检测甲型副伤寒沙门菌的试剂盒。

为了实现本发明目的，本发明的一种甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物，其包括：

正向引物：5’-CCTGTTAGAAGTGTTTACAACTT-3’和

反向引物：5’-GCTAAACCACCAAATTGTGT-3’。

本发明进一步提供含有上述引物的用于检测甲型副伤寒沙门菌的试剂盒。

本发明针对甲型副伤寒沙门菌hsdM基因设计特异性引物，建立检测该靶基因的逆转录荧光PCR方法，利用35个血清型的纯培养甲型副伤寒和非伤寒沙门菌菌株、常见非沙门致腹泻病原菌以及发热为主要症状的8种常见病原菌RNA来评价该方法的特异性及敏感性，同时对甲型副伤寒沙门菌全血模拟标本进行检测下限确定。结果表明，利用该方法检测44株甲型副伤寒沙门菌均呈阳性，其余34种非伤寒沙门菌血清型、致腹泻的其他5种肠道致病菌以及发热为主要症状的8种常见非沙门菌扩增结果均为阴性，说明该方法的特异性、敏感性均较高，达100％。在对纯菌总RNA检测中，逆转录荧光PCR的最低检测限为5pg/反应，约为1900个拷贝/反应。在以全血模拟样品提取核酸为模板的检测中，最低检测限达40cfu/mL。

附图说明

图1为本发明逆转录荧光PCR扩增产物凝胶电泳图；其中，1为阴性对照，2为伤寒沙门菌样品，3为乙型副伤寒沙门菌，4为丙型副伤寒沙门菌，5为鼠伤寒沙门菌，6为肠炎沙门菌，7-29为甲型副伤寒沙门菌样品，30为甲型副伤寒沙门菌阳性对照，M为DNA分子量Marker。

图2为本发明逆转录荧光PCR检测纯菌RNA扩增曲线图；其中，a～h对应的模板浓度为，a：0.5×10⁷pg/反应；b：0.5×10⁶pg/反应；c：0.5×10⁵pg/反应；d：0.5×10⁴pg/反应；e：0.5×10³pg/反应；f：0.5×10²pg/反应；g：0.5×10¹pg/反应；h：0.5pg/反应；NC：阴性对照。

图3为本发明逆转录荧光PCR检测血模拟标本扩增曲线图；其中，a为阳性对照，b～g对应的模板浓度为，b：7×10⁵cfu/ml；c：7×10⁴cfu/ml；d：7×10³cfu/ml；e：7×10²cfu/ml；f：7×10cfu/ml；g：7×10⁰cfu/ml；NC：阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例甲型副伤寒沙门菌的逆转录荧光PCR检测用引物的设计及检测方法

1材料与方法

1.1实验用菌株

本实施例中使用的甲型副伤寒沙门菌44株，伤寒沙门菌、乙型和丙型副伤寒沙门菌以及其他31种非伤寒沙门菌血清型共57株(表1)，所有血清型均使用沙门菌抗血清(购自Statens Serum Institut，SSI，丹麦)进行血清型鉴定。另外，其他肠道常见病原菌及引起发热并可在血液标本中分离到的肺炎链球菌、伯氏疏螺旋体、钩端螺旋体、嗜肺军团菌、脑膜炎奈瑟菌、立克次体、布鲁氏菌等菌株(表1)用于特异性及敏感性评价，上述菌株均来自中国疾病预防控制中心传染病预防控制所。

1.2引物设计