[发明专利]杀菌肽LL-37的基因工程的表达及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，包括合成编码杀菌肽LL-37的DNA序列，连接到表达载体：GST载体或pUC18载体或pEZZ载体，在原核表达系统大肠杆菌JM109中进行表达和纯化，其中LL-37基因工程菌的表达载体中的单链DNA结构SEQ ID：

-CTG-CTG-GGT-GAT-TTC-TTC-CGT-AAA-AGC-AAA-GAA-AAA-ATC-GGT-AAA-GAA-TTC-AAA-CGT-ATC-GTT-CAG-CGT-ATC-AAA-GAT-TTC-CTG-CGT-AAC-CTG-GTT-CCG-CGT-ACC-GAA-AGC。

2.如权利要求1所述的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，其中所述的杀菌肽LL-37还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

3.如权利要求2所述的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，其中所述的载体是DDH20或生理盐水。

4.如权利要求2所述的杀菌肽LL-37的基因工程的表达方法，其中所述的辅料是异丙醇及丙二醇或γ-多聚谷氨酸。

5.一种杀菌肽LL-37的基因工程制备方法，包括基因重组、重组融合蛋白的获得纯化和切断，目的多肽的纯化，其步骤如下：

(1)为合成基因工程菌LL-37，用化学合成的方法合成编码LL-37的DNA序列连接在载体蛋白上，之间以大肠杆菌偏爱的甲硫氨酸Methionine的DNA密码子ATG连接；

(2)为合成基因工程菌LL-37，将载体蛋白-Methionine-LL-37的DNA序列插入Lac质粒载体；

(3)将上述重组质粒转入大肠杆菌JM109进行表达，得到基因工程菌杀菌肽LL-37菌株；

(4)将菌株置于营养丰富的LB培养基中发酵，发酵温度37℃，发酵时间为12-24小时，发酵液中加入氨苄西林使其最后浓度为50μg/ml，以及IPTG，终浓度为0.5mM，发酵结束后离心获得菌体，经细胞粉碎，包涵体复性，融合蛋白的分离纯化；

(5)冻干后融合蛋白加入70％甲酸反应体系(蛋白浓度1mg/ml)，通氮气1小时后，加入溴化氰的乙腈溶液，W溴化氰/W融合蛋白＝100∶1，W溴化氰/V乙腈＝1g∶1ml，封瓶后黑暗中磁力搅拌7天，加入2N氢氧化钠调节至pH5-6，溶液呈无色，终止反应，2000分子量透析过夜，冻干除去溴化氰，加60％乙腈溶解，制备RP-HPLC C18柱(φ30X300mm，Agilent，USA)。线性梯度20-80％乙腈，含0.1％三氟乙酸，30ml/min 30分钟一个周期。220nm的每个峰均进行小肽蛋白电泳分析。收取目的多肽。旋蒸后冻干，获得重组LL-37粉末，纯度＞90％；

(6)杀菌肽LL-37粉末溶于载体或辅料形成药品用于治疗。

6.如权利要求5所述的杀菌肽LL-37的基因工程制备方法，杀菌肽LL-37形成药品用于治疗皮肤感染。