[发明专利]一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其应用于神经干细胞转染方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物与医学临床上DNA等核酸结合介质，特别涉及一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法及其应用于神经干细胞转染方法。

背景技术

基因转染是众多基础和应用研究中的关键步骤，基因调控、蛋白表达及功能、转基因等研究都离不开转染。在神经干细胞的基因转移方面，其转染途径及策略一直是核心问题，基因转移的效率已成为神经干细胞基因修饰研究中的瓶颈。如常规的基因转染方法，在其他细胞中具备很高的转染效率，但在神经干细胞则很难达到理想的状态。

选择合适的载体已成为基因转染和基因治疗的一大难点，病毒载体虽然DNA导入效率高(通常在80％以上)，但其存在着病毒毒性、免疫原性、有限的DNA装载量和随机插入整合的安全性隐患等一系列问题，使其应用受到了很大限制。非病毒载体因其低免疫原性、低毒、靶向性和易于组装等优点，而被人们寄予厚望，但外源性的目的DNA导入效率低下。如以脂质体为载体转染虽然能转染大部分癌细胞及正常细胞，但对于难转染的如神经干细胞等细胞，其转染效率不到5％甚至低于1％，同时该载体的毒性会造成大量的细胞死亡。其次是采用不需要载体的电穿孔方法，该方法也是大多数实验室常用的一种细胞转染方式，但用电穿孔转染不同的细胞需要对转染的参数重新设置，电转参数的微小差别可能对转染效率影响很大，同时电穿孔对细胞损伤较大，且容易造成染色体断裂等不确定因素。其他的非病毒转染方法都用得较少，但都存在转染效率低和适用性不广以及安全方面的问题。因此，采用新策略开创新方法，探索与开发新载体成为必然趋势。

发明内容

针对背景技术中的问题，本发明目的在于提供一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法，并应用于神经干细胞转染。

为实现上述目的，本发明明提供以下技术方案：

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

1)在烧杯中分别加入环己烷40mL，Triton X-10010mL，正己醇10mL，磁力搅拌器min，室温；

2)加入1mL双蒸水，继续搅拌30min；

3)等比例混合AEAPS(N-(β-氨乙基)-γ-氨丙基三乙氧基硅烷)和TEOS(正硅酸乙酯)，加入AEAPS与TEOS混合液至2)；

4)加入氨水0.5mL，继续搅拌1小时；再加入氨水0.5mL，搅拌24小时；

5)加入30mL丙酮，搅拌摇匀30min，分装至2个50mL超速离心管；13000rpm离心20离心，22℃；

6)弃上清，各管加30mL丙酮，振匀，37℃，100％功率快速超声分散；13000rpm离心20min，22℃；

7)弃上清，各管加75％酒精30mL，振匀，370C，100％功率快速超声分散；13000rpm离心20min，22℃；

8)弃上清，各管加双蒸水30mL，振匀，37℃，100％功率快速超声分散；13000rpm离心20min，22℃；

9)弃上清，各管加双蒸水15mL，振匀，37℃，100％功率快速超声分散；

10)冷冻真空干燥待用。

作为本发明的优选技术方案，所述步骤1)中的环己烷、Triton X-100、正己醇的比例为4∶1∶1；所述步骤3)中的AEAPS与TEOS比例为1∶1。

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒应用于神经干细胞转染方法，采用纳米颗粒介导DNA直接转染法，包括如下步骤：

1)在6孔板中，采用无血清单层培养体系培养培养神经干细胞至对数生长期(60-80％汇合度)；

2)在总体积100uL的转染体系中，加入2-4ug质粒载体与0.1-0.2ug氨基化修饰二氧化硅纳米颗粒悬液混匀，在室温结合15-20min；

3)将混合液逐滴加入到6孔板中，轻轻摇匀，置37℃、5％CO2恒温培养箱培养；

4)24小时后换液，观察基因转染效果。

进一步的，所述步骤3)中的刮下的细胞呈团块状。

一种高效结合DNA的二氧化硅纳米颗粒应用于神经干细胞转染方法，采用联合电穿孔与二氧化硅纳米颗粒介导DNA转染法，包括如下步骤：

1)在6孔板中，采用无血清单层培养体系培养培养神经干细胞至对数生长期(60-80％汇合度)；

2)在总体积100uL的转染体系中，加入2-4ug质粒载体与0.1-0.2ug氨基化修饰二氧化硅纳米颗粒悬液混匀，在室温结合15-20min；

3)采用机械法将1个孔的神经干细胞刮下；