[发明专利]H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种病毒标准样品的制备方法，尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法。

背景技术

禽流感（Avian Influenza，AI）又称真性鸡瘟或欧洲鸡瘟，是由A型流感病毒引起的一种禽类感染和/或疾病综合征。流感病毒（Avian Influenza virus，AIV）根据对禽的致病性大小可以分为非致病性、低致病性（Low Pathogenic Avian Influenza, LPAI）和高致病性（Highly Pathogenic Avian Influenza,HPAI）三种。动物感染禽流感病毒后症状不一，感染非致病性禽流感没有明显症状；感染低致病性禽流感可有轻度呼吸道症状，病禽出现零星死亡；感染高致病性禽流感最严重，被感染鸡群的死亡率通常是百分之百。

 H9N2亚型禽流感（H9 subtype avian influenza virus）仍是我国当前低致病性禽流感流行的主型 ，1995年唐秀英等从四川省某发病鸡群中分离到一株H9N2毒株，从西昌发病鸡群中分离到了2株H9N2毒株。此后又从我国部分地区的发病鸡群、鸭群中，分离到16株H9N2病毒。近几年，对我国部分省市商品鸡场进行的禽流感血清学调查中发现，221个禽流感阳性鸡群中H9亚型阳性鸡群占阳性群总数的93.67％，H5亚型阳性鸡群、H4亚型阳性鸡群、H14亚型阳性鸡群占阳性鸡群总数的6.33％，证实了H9N2亚型禽流感在我国广泛存在。 

以前观念认为禽流感和人是有种属屏障的，但近几年的禽流感感染人事件表明，这种屏障正在减弱或消失，不仅在鸡、鸭、鹅、候鸟等禽类上发生，而且也已经波及到老虎、海狮、人等哺乳类动物，爆发的规模及危害也在不断加大。1997年香港Peiris等从类似流感症状的病人分离到H9亚型流感病毒一例，2003年又有两例病人分离到H9亚型病毒。刘红旗等研究发现H9N2亚型在中国大陆形成了一个稳定的亚系，这不仅对养禽业有巨大危害，而且严重威胁人类健康。并且，新的研究表明，H9N2亚型部分流行株的致病力明显变异，尤其对肉仔鸡，死亡率可达到30％以上；对产蛋高峰期的蛋鸡，其产蛋下降幅度大，恢复困难。

目前，人们已经广泛开展对H9N2亚型禽流感的研究，而实验室的质量控制一直都是人们所关注的，针对内部质量控制，现有实验室基本上都使用自己制备的H9N2亚型禽流感样品，不仅样品制备过程费时费力，而且很难保持活菌的稳定，难以实现不同实验室结果的比对。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种H9N2亚型禽流感病毒标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：

a. 将H9N2亚型禽流感病毒株用生理盐水作10倍连续稀释至10^-8，每个稀释度接种5枚10日龄SPF鸡胚，每胚0.1 ml，接种后置于37℃继续孵育，每日照蛋；

b.  逐个收获接种72~120h死亡鸡胚及120 h活胚的尿囊液，分别测定每个鸡胚尿囊液的HA价，并以最高稀释度病毒感染的一枚鸡胚中的尿囊液作为传代接种物；

c.  依次重复a、b步骤两次，重复过程中a步骤的H9N2亚型禽流感病毒株为b步骤所产生的传代接种物；

d.  将最后一次b步骤所产生的传代接种物用生理盐水作10倍稀释，将10倍稀释液接种于10枚10～11日龄SPF鸡胚的尿囊腔内，接种后继续孵育，每日照蛋，收获接种72～120 h死亡鸡胚尿囊液，分装安瓿，-80℃温度保存。

本发明不仅制备过程省时省力，而且所制备的H9N2亚型禽流感病毒标准样品稳定性高、均匀性好，可以为H9N2亚型禽流感病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。

附图说明

图1是本发明实施例标准样品HA、NA基因RT-PCR扩增电泳图。

图2是本发明实施例标准样品HA基因核苷酸序列系统发育树。

图3是本发明实施例标准样品NA基因核苷酸序列系统发育树。

具体实施方式