[发明专利]杨树糖基转移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种糖基转移酶的应用，尤其涉及一种杨树糖基转移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的应用；属于生物技术领域。

背景技术

植物天然成分中有一类苯环和3个直链碳连在一起为单位的化合物，统称为苯丙素(Phenylpropanoids)。例如芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸、阿魏酸、咖啡酸等等。许多苯丙素的糖苷是中草药的有效成分，在抗氧化、解肝毒、止哮喘、防肿瘤等方面有重要药用价值。在医药工业或化学工业，获得苯丙素糖苷的途径主要有两种：从植物中提取和化学合成。由于在植物中这些天然产物含量很低，提取量非常有限，纯度难以保证，并且提取过程复杂。如果用化学方法合成，也有过程复杂、成本高、环境污染等缺点。相比之下，生物酶法合成糖苷化合物则具有效率高、成本低、环境清洁等优点。

植物体内有一类酶，被称为糖基转移酶，它们专门负责植物体众多化合物的糖基化修饰，即催化某些化合物形成相应的糖苷(或糖酯)。糖基化是一种普遍的生理现象，是植物细胞维持代谢平衡的主要机制之一，在维持植物正常生长发育、应对环境压力等方面具有重要的作用(Lim et al，2004；王军等，2009)。到目前为止，生物界存在的糖基转移酶按照催化的底物性质和序列相关性可以分为94个家族。其中家族1(GT1)的酶所催化的底物是一些亲脂性的小分子化合物，在其-OH、-COOH、-NH₂、-SH或C-C基团上能催化结合上一个或多个糖基(Bowles et al.2005)。但是，针对苯丙素化合物的糖苷合成，至今还没有发现相关的糖基转移酶。在医药工业、化学工业以及生物技术等领域，也没有利用糖基转移酶催化苯丙素糖苷合成的先例。

杨树是我国重要的经济树种和生态防护林树种。随着杨树基因组测序计划的完成，杨树中功能基因的克隆和功能基因组学的研究被大大推进(尹佟明等，2010)。虽然有研究报道杨树中存在大约800多种不同的糖基转移酶，其中能够催化小分子化合物糖苷形成的糖基转移酶占多数(Geisler-Lee等，2006)，但是经过检索，目前尚未发现有关杨树糖基转移酶在催化合成苯丙素糖苷中的应用的报道。

发明内容

(1)本发明的目的

针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种杨树糖基转移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的应用。

(2)实现本发明的具体技术方案

本发明所述的杨树糖基转移酶PtGT2在催化合成苯丙素糖苷中的应用。

其中：

所述糖基转移酶PtGT2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。该糖基转移酶是通过糖基转移酶基因PtGT2在大肠杆菌中表达和纯化后获得的。糖基转移酶基因PtGT2是通过RT-PCR方法从杨树中克隆的。

所述苯丙素是指芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸或阿魏酸。将糖基转移酶PtGT2与这些苯丙素之一放于反应管中，按实施例2中所指出的条件进行酶促反应，即可催化合成相应的苯丙素糖苷。

(3)本发明实施后带来的有益效果

本发明是在国内外首次证明杨树的糖基转移酶PtGT2可以催化多种苯丙素化合物生成其糖苷物质。本发明的公开为体外利用酶催化方法合成这些苯丙素物质的糖苷物提供了可行的方法。用提取方法或化学合成方法获得苯丙素糖苷物不仅效率低，而且缺乏专一性。而用糖基转移酶PtGT2催化方法则可以高效、专一性的合成芥子醇、芥子醛、松柏醇、松柏醛、芥子酸或阿魏酸相对应的的糖苷(见附图1至附图7)。本发明实施后将为苯丙素糖苷合成工业带来巨大经济效益。

附图说明

图1.纯化的融合蛋白GST-PtGT2用SDS-PAGE检测。其中，M为蛋白质分子量标记；序号1泳道为GST标签蛋白，作为对照；序号2泳道为纯化的PtGT2-GST融合蛋白，其中有一条微弱的GST带，是一种在pGEX纯化系统中比较常见的现象。

图2(A).纯化后的融合蛋白GST-PtGT2催化芥子醇形成糖苷，催化产物用HPLC分析。其中1为紫丁香苷标准品；2为对照组，纯化的GST标签蛋白与芥子醇和UDP-葡萄糖的反应体系，无糖苷合成；3为实验组，纯化的GST-PtGT2融合蛋白与芥子醇和UDP-葡萄糖的反应体系，比只含有GST标签蛋白的对照反应体系多出一个明显的峰(箭头c所指)，即合成了紫丁香苷(芥子醇-4-O-葡萄糖苷)。图中的a为UDP-葡萄糖，b为底物芥子醇。