[发明专利]原发性胆汁性肝硬化特异性自身抗原及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物标志物领域，具体涉及原发性胆汁性肝硬化抗原标志物及其应用。

背景技术

原发性胆汁性肝硬化(PBC)是一种慢性胆汁淤积性肝脏疾病，以肝内中小胆管的进行性破坏为主要特征，最终导致肝硬化和肝功能衰竭的一种疾病(Poupon，R 2010，Selmi，C.2011)。其病理学表现为汇管区炎症，淋巴细胞围绕受损的胆管周围，并浸润至胆管基底膜和胆管上皮细胞内，胆管上皮细胞呈空泡状变性坏死，进而引起上皮样组织细胞增生，形成肉芽肿，这种形态学特点提示胆管上皮是PBC免疫攻击的目标。PBC最常见的临床症状为乏力和皮肤瘙痒。与胆汁淤积有关的PBC特殊并发症主要有骨质疏松、脂溶性纤维素缺乏、高脂血症和脂肪泻等。在疾病后期，可发生肝硬化和门脉高压的一系列与其他原因导致的肝硬化所致者基本类似的并发症，如腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血和肝性脑病等。

PBC最主要的血清生化指标就是血清碱性磷酸酶(ALP)和γ-谷氨酰转肽酶(Gamma-glutamyltransferase，γ-GT)升高，一般升高3-4倍，并且可见于疾病的早期和无症状期。但是谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)通常正常或轻度至中度升高。早期患者没有黄疸，但随着病情的进展，在较晚期的患者中血清胆红素明显升高，血清胆红素水平有助于判定PBC患者的预后及决定肝移植的时机。高胆红素、低白蛋白血症和延长的凝血酶时间都是预后不良的指标。此外，PBC患者的血清胆汁酸水平通常会升高。

血清中存在抗线粒体抗体(AMA)是PBC的重要标志。AMA并非PBC唯一的特异性自身抗体，在PBC血清中亦可检测到抗核抗体(ANA)，有呈现核模型(M-ANA)，有呈现多核点型(multiplenuclear dots，MND)。此外，部分PBC患者表现有抗平滑肌抗体阳性、抗甲状腺抗体、抗DNA抗体和类风湿因子等自身抗体。

自从医学工作者发现某些疾病患者的血清呈现特异的免疫荧光染色模式后，探索这些自身抗体所针对的自身抗原以及建立相关检测技术的工作就一直在进行。鉴定自身抗原方面，起初通过免疫荧光技术和细胞生物学知识初步确定靶抗原的细胞定位，再通过分离提取不同的细胞器，确认自身抗体识别的蛋白质在细胞中较精细的定位。随着蛋白质电泳技术、免疫印迹技术及生物质谱技术的发展，越来越多的自身抗原被鉴定。近年来，随着cDNA表达文库技术以及高通量重组蛋白表达纯化技术的运用，特别是高通量蛋白质芯片技术的发展，自身抗原的鉴定工作变得越来越简单、方便和快捷。

另一方面，自身抗体的临床实验室检测技术也取得了飞速发展，从起初的基于组织和/或细胞的免疫组织化学技术及免疫荧光技术，到传统的沉淀反应、免疫电泳技术、凝集试验、补体结合试验技术等。随着分子生物学的发展，特别是重组蛋白表达技术的发展，各种标记免疫测定技术(包括酶联免疫测定技术、放射免疫技术、荧光免疫测定、化学发光免疫测定和金免疫技术等)已成为主要的免疫测定技术。此外，免疫印迹法也发挥了明显的作用。近年来，随着基因组学和蛋白质组学技术的发展，蛋白质芯片技术以其较高的检测灵敏度在自身抗原鉴定方面发挥了重要作用，目前已有不少于21种蛋白质芯片用于临床(Hartmann，M.，J 2009)，其中至少有5种经FDA认证批准用于自身免疫性疾病的诊断。

目前，自身抗原鉴定的方法主要包括以下五种：1)SEREX技术；2)噬菌体展示技术；3)SERPA技术；4)蛋白质芯片技术；5)MAPPing技术。其中SEREX技术、噬菌体展示技术需要构建表达文库，经过数轮的生物淘洗，最终确定候选自身抗原的身份，程序繁琐，耗时耗力。此外还存在以下缺点，1)筛选到的表位主要以大肠杆菌容易表达的线性表位为主；2)由于大部分的文库是从肿瘤组织或细胞中提取mRNA制备cDNA的，表达文库倾向于原本就是较高丰度的胞内蛋白，而自身抗体识别的自身抗原大部分都是表达量较低的蛋白质。

SERPA技术是伴随中蛋白质组学技术的发展而产生的，在鉴定识别蛋白质翻译后修饰自身抗体方面有独特的优势，并且也摆脱了构建表达文库费时费力的工作，但是由于双向电泳技术分离细胞全蛋白的能力所限，特别是极端分子量和等电点的蛋白质抗原的分离，以及电泳过程中天然蛋白质构象被破坏，筛选到的自身抗体仍然以识别线性表位为主。