[发明专利]抗p185erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法

说明书

技术领域

本发明涉及慢病毒表达载体，尤其是一种抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法。

背景技术

c-erbB2/HER2/neu编码产物p 185^erbB2是具有酪氨酸激酶活性的跨膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体(EGFR)家族成员。c-erbB2/HER-2/neu基因的扩增和p185^erbB2蛋白的过度表达见于多种恶性肿瘤，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、子宫内膜癌、胃癌、前列腺癌和肺腺癌。p185^erbB2过度表达提示肿瘤预后差，如转移、复发、易耐药及存活期短等。因此，p185^erbB2作为肿瘤抗原，是一个理想的肿瘤治疗靶点。1998年10月，美国食品及药物管理局(FDA)正式批准将一株抗p185^erbB2人源化抗体Trastuzumab(商品名Herceptin)用于临床治疗p185^erbB2高表达的转移性乳腺癌。但是，国外进口抗体药物价格昂贵，如何开发出拥有自主知识产权的抗p185^erbB2基因工程抗体对于国内患者具有十分重要的实际意义，其中，表达载体构建尤为关键。

目前对鼠单抗的人源化技术包括将鼠单抗恒定区替换为人的恒定区的嵌合抗体；将鼠单抗除互补决定区外的部分均替换为人的序列的改型抗体；将抗体片段进行改型的小片段抗体(包括：Fab片段、单链抗体和双链抗体等)；从抗库中直接筛选人抗体基因的抗体库技术。许多临床应用研究已经证明，大多数嵌合抗体在人体内只引起极弱的、甚至未引起HAMA反应，同时嵌合抗体较改型抗体和小分子抗体能更好地保持亲本鼠单抗的亲合力和特异性，而且构建表达技术较改型抗体和噬菌体抗体库技术更成熟、简单和成本低。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体及其构建方法，为今后抗p185^erbB2嵌合抗体的基础研究及临床应用奠定了基础。

为解决上述技术问题采用如下技术方案：抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体，该载体是pWPI/H-IRES-L，其中H和L分别是抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体重链基因(SEQ.ID.No.2)和抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体轻链基因(SEQ.ID.No.1)。

上述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，利用PCR法扩增出抗人p185^erbB2鼠源性单抗可变区基因vH和vL以及人IgG1的恒定区基因γ1和κ；再采用三引物PCR法将vH和γ1，vL和κ进行拼接，得到嵌合重链H和嵌合轻链L基因，分别插入质粒pVAX1/IRES的IRES元件的上、下游；用内切酶将H-IRES-L从pVAX1/H-IRES-L上切下，插入慢病毒载体pWPI中，即得。

上述抗p185^erbB2人鼠嵌合抗体慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：

<1>鼠抗人p185^erbB2单抗轻、重链可变区基因(vL、vH)和人IgG1轻、重链恒定区基因(κ、γ1)的扩增

以质粒pSRNC/Cκ-ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用L-A和L-B、Kappa-A和Kappa-B扩增出带信号肽的轻链可变区基因vL和人IgG1轻链恒定区基因κ；以质粒pSRDC/Cγ1-ZC26为模板，在Taq DNA聚合酶作用下分别用H-A和H-B、gamma1-A和gamma1-B扩增出带信号肽的鼠单抗重链可变区基因vH和人IgG1重链恒定区基因γ1；扩增反应条件为94℃预变性5min，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min 30s，35个循环，72℃延伸10min；用胶回收试剂盒纯化回收PCR产物；

<2>嵌合轻链基因L和嵌合重链基因H的拼接