[发明专利]一种重金属镉抗性相关蛋白DbsCzcA及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物基因工程，和生物修复领域。具体地说，本发明提供了生活在酸性矿山废水(acid mining drainage，AMD)的一种未知微生物所含有的一种对重金属镉抗性的基因即阳离子外排系统蛋白基因(DbsCzcA)的序列，以及该序列推测编码蛋白质分子的氨基酸序列。本发明在提高微生物和植物对重金属镉的抗性方面有着重大的应用价值。

背景技术

随着矿产资源的开发利用、工业发展，重金属对环境造成的污染日趋严重，土壤重金属污染已经成为一个危害全球环境质量的问题。土壤重金属会影响植物的生长发育，降低农作物的产量和质量，带来了严重的经济损失。此外，受土壤重金属污染的作物在植物体中积累，并通过食物链富集到人体和动物体中，危害人畜健康，引发癌症和其他疾病等。治理重金属污染刻不容缓，各种修复技术和措施正在研究和应用中。各国政府和科学家着力通过两个途径解决这一问题：一为利用物理的，化学的方法试图清除土壤或水体的重金属污染：二为利用现代生物技术清除污染。自从20世纪80年代以来，生物修复技术因其具有处理费用低、对环境影响小、效率高等优点，越来越受到广大科技人员的广泛关注。生物修复一般分为植物修复、动物修复和微生物修复三种类型，其中植物修复和微生物修复是研究的热点。微生物修复就是利用微生物将环境中的污染物降解或转化为其他无害物质的过程。近年来，基于微生物对重金属的作用机理，以修复有毒有害金属污染或回收有经济价值重金属为目的的生物处理技术日趋成熟。植物修复指利用植物去治理水体、土壤和底泥等介质中的污染的技术。然而用于重金属污染修复的生物往往会受到重金属的毒害，生长缓慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金属对植物和微生物的毒害作用是生物修复的主要限制因素。

解决生物修复中重金属对生物的毒害作用的根本途径在于研究耐受重金属的分子生物学机制，克隆对重金属耐受的关键基因，通过基因工程手段获得用于生物修复中性能优良的转基因工程生物。

由于技术上的原因，直到最近，对微生物基因资源的利用主要局限于可培养微生物。然而，已培养微生物仅占自然界中微生物的不到1％，因此各种生境中的微生物宏基因组是一个巨大而未发掘的基因资源库。极端环境具有丰富的微生物资源，当中许多与逆境和关键生命过程相关的基因在长期的适应进化中获得了更强的耐性潜能，发掘这些抗性基因已成为国际重要的研究热点。酸性矿山废水(AMD)是极端生境微生物学研究的重要系统。AMD来源于采矿活动使含硫矿物(主要为黄铁矿，FeS₂)暴露于空气和水中，在微生物催化作用下迅速氧化产酸所致，其pH值一般在1-4左右，而且富含硫酸盐以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金属，是采矿业面临的最严重环境问题之一。在AMD中生存的原核微生物在长期的进化过程中逐渐形成了一些独特机制，以应对低pH值、高盐度以及高重金属等多种极端环境协迫。因此，AMD生境成为极具特色和丰富的抗逆基因库。

镉(Cd)是一种极其重要的工业和环境化学污染物，因其对环境水、空气和土壤的污染而在动植物体内蓄积，最终导致对人类健康的危害，并由于它在体内能长期蓄积，不易排除，故易产生慢性的和远期的病理效应，可损伤许多组织和系统。把生物体内的镉离子快速排出是一种有效的解毒方式。

Czc是一种膜结合的蛋白复合体，它通过主动运输把细胞内的Co²⁺，Zn²⁺和Cd²⁺排出到细胞外，从而解除这些重金属离子的毒性。在这个蛋白复合体中，CzcA编码一个阳离子/质子对流泵，CzcB编码一个亚基与阳离子结合，CzcB主要与Zn2+结合，CzcC与CzcB结合，使CzcB构象发生改变，能与Co²⁺和Cd²⁺结合。，CzcD、CzcE、CzcS和CzcR编码四个CzcCBA操纵子，对Czc复合体起着调控的作用。但CzcD、CzcE、CzcS和CzcR对这个Czc蛋白复合体的表达并不是必需的。

Nies等发现CzcR and CzcD影响Alcaligenes eutrophus通过Czc重金属外排系统对钴，锌，镉的抗性。Legatzki研究表明Ralstonia metallidurans的Czc系统与另外两个P型ATP酶相互影响，对提高它对重金属的抵抗力都有一定的作用。在Ralstonia metallidurans中czcNp启动子控制着Czc复合体的表达，从而决定着它对重金属的抵抗能力。

发明内容