[发明专利]一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于酶联免疫检测技术领域，具体涉及一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒。

背景技术

胃食管反流病(CERD)是一种胃内容物反流引起不适症状和(或)并发症的疾病，是消化系统常见疾病，西方国家发病率约为7％-27％，我们国家CERD的发病也呈增加趋势约为9.1％-22.5％，但目前CERD的检测相当麻烦。因此我们建立了胃蛋白酶酶联免疫分析的检测方法以辅助临床进行鉴别诊断。胃蛋白酶((Pepsin)是一种酸性蛋白酶，由胃粘膜主细胞释放的胃蛋白酶原转化而来，分子量35Kd，是胃液中的主要消化酶，能裂解蛋白质的肽键，从而使蛋白质在胃内得到初步消化。但在某些情况下发生胃液反流时，胃液中少量的胃蛋白酶就可以破坏原有黏膜的正常结构，损害细胞间或细胞膜上的蛋白，破坏胞间连接和信号转导，引起严重的并发症，如咽部炎症、反流性食管炎，若反流至中耳可引起中耳炎，若误吸至肺，不仅引起气道粘膜损伤，还会导致肺泡萎缩和肺不张，甚至引起急性呼吸衰竭。最近有研究发现胃蛋白酶升高与异体肺移植排斥有关，在异体肺移植患者支气管肺泡灌洗液中胃蛋白酶水平持续性升高，与肺移植急性排斥有关。因此建立胃蛋白酶水平的监测对反流性咽炎的鉴别诊断、及早发现胃液反流、预防和治疗胃内容物误吸、防治误吸后急性呼吸衰竭以及检测肺移植患者排斥反应具有非常重要的意义。

目前国内还没有用同株多克隆抗体建立夹心酶免疫分析法检测胃蛋白酶的研究和使用报道，国外相关文献报道也很少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒对反流性咽炎的鉴别诊断、及早发现胃液反流、预防和治疗胃内容物误吸、防治误吸后急性呼吸衰竭以及检测肺移植患者排斥反应具有非常重要的意义。

一种胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒，该试剂盒由固相酶标板、胃蛋白酶标准品、辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体和辅助试剂组成。

所述辣根过氧化物酶标记的胃蛋白酶抗体的制备方法如下：称取2.5mg辣根过氧化物酶溶于0.5ml三蒸水中，加NaIO₄进行醛化后，用50mmol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液调PH≥9.0，在磁力搅拌下将3.5mg/200μL的胃蛋白酶抗体溶液滴加到醛化的辣根过氧化物酶溶液中，4℃搅拌反应2h，加入0.4％的NaBH₄100μL于反应液中，4℃反应2h，用10mmol、pH 7.8的PBS透析过夜，次日，将反应液离心，取上清加入等体积甘油，分装冻存。

所述胃蛋白酶抗体的制备方法如下：首次免疫将胃蛋白酶600μg与弗氏完全佐剂4ml混匀，分别与3只兔背部皮内注射，每隔4周进行加强免疫，所述加强免疫是将免疫原300μg与弗氏不完全佐剂4ml充分混匀后注射，第4次免疫后7天经动物颈动脉放血，分离血清，检测抗血清效价，选取效价最高者进行分装，-80℃保存。

所述辅助试剂包括：显色液、反应终止液、底物工作液、洗涤液和缓冲液。

本发明的有益效果：本发明的试剂盒使用时将胃蛋白酶标准品与样本中待测胃蛋白酶同时等体积加入固相抗体板中，经过反应洗涤后再加入酶标抗体，经过反应洗涤后加入显色剂，根据颜色深浅判断待测物中胃蛋白酶的含量；用该方法检测62份正常人唾液和23例反流性食道炎患者唾液，表明该方法实用可靠。

附图说明

图1为胃蛋白酶酶联免疫分析标准曲线。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

以下实施例并不限定本发明，实施例中未详细说明的操作步骤请参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分(J.萨姆布鲁克E.F.弗里奇等，科学出版社)或参阅所用试剂盒的说明书。

实施例1胃蛋白酶酶联免疫分析检测试剂盒的制备

1、材料

免疫用大耳白兔3只，雄性，体重1.5公斤，由301医院动物实验中心提供。人胃蛋白酶购于sigma公司，弗氏完全、不完全佐剂为本实验室自制，胰蛋白酶、淀粉酶、抗胰蛋白酶、分泌型IgA均购于Sigma公司，正常人唾液及反流性食道炎患者支气管分泌物样品均来自中国人民解放军总医院。

2、胃蛋白酶抗体的制备和纯化

(1)抗血清制备首次免疫将胃蛋白酶600ug与弗氏完全佐剂4ml充分混匀，分别与3只兔背部皮内多点注射，每隔4周进行加强免疫(将免疫原300ug与不完全佐剂4ml充分混匀后同上法注射)。于第4次免疫后7天经动物颈动脉放血，分离血清，检测抗血清效价，选取效价最高者进行分装，-80℃保存。