[发明专利]一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法

权利要求书

1.一种草鱼白细胞介素10酶联免疫检测方法，其特征在于该检验方法是利用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗草鱼白细胞介素10的多克隆抗体和重组草鱼白细胞介素10蛋白建立的竞争抑制酶联免疫检测方法。

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

1)抗原蛋白的制备

利用原核表达系统制备重组草鱼白细胞介素10蛋白作为抗原蛋白。

2)草鱼白细胞介素10多克隆抗体的制备

以重组草鱼白细胞介素10蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔并利用多克隆抗体制备与纯化技术获得草鱼白细胞介素10多克隆抗体，该抗体可与草鱼白细胞介素10特异的结合。

3)草鱼白细胞介素10多克隆抗体的辣根过氧化物酶标记

采用马来酰亚胺活化的辣根过氧化物酶标记草鱼IL-10多克隆抗体。

4)ELISA操作方法

(1)经过棋盘滴定法确定ELISA检测时辣根过氧化物酶标记的草鱼白细胞介素10多克隆抗体的最适稀释倍数为1∶2000，包被抗原浓度为2μg/mL，每孔100μL。

(2)包被：以0.05M的碳酸盐缓冲液稀释草鱼白介素10重组蛋白至2μg/mL，以此作为包被原加入酶标板中，每孔100μl，4℃孵育过夜后甩干孔内液体，并用PBST(pH为7.4的PBS缓冲液中含0.05％Tween-20)洗涤三次，每次300μl/孔，3分钟每次。

(3)封闭：用封闭液(pH为7.4的PBS稀释的5％脱脂奶粉、0.3％BSA溶液)室温封闭两小时，300μl/孔。

(4)酶标抗体与待测抗原的孵育：用抗原/抗体稀释液(PBST)将重组草鱼重组IL-10蛋白稀释到对应浓度(0.2ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、200ng/mL)作为标准品，取各标准品50μl与50μl酶标IL-10多克隆抗体(HRP-IL10Ab)(PBST做10³倍稀释)混匀后室温孵育2小时。对待测样品的检测：取待测样品50μl后与50μl 1∶1000稀释的HRP-IL10Ab混合，同样室温孵育2小时。酶标板封闭完成后甩干封闭液，并用300μl PBST洗涤三次，加入上述抗原抗体混合液，室温孵育2小时。

(5)显色：甩干孔内液体，用300μl PBST洗涤五次，每次3分钟，洗涤后一定注意甩干孔内液体，然后加入100μl TMB底物，37℃反应20分钟后加入50μl 2M H₂SO₄终止反应。

(6)读数、结果处理：采用酶标仪在吸光度450nm下读取数据，根据所得数据计算样品抑制率。样品抑制率％＝(阴性样品吸光值-标准品/待测样品吸光值)/阴性样品吸光值×100％，最后以标准品抑制率为纵坐标，标准品浓度的对数为横坐标制作标准曲线，以标准曲线对待测样品进行定量分析。