[发明专利]一种高表达赖氨酸的基因

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及转基因-克隆技术领域。用于在鼠奶中高表达赖氨酸重组蛋白，为建立高表达赖氨酸转基因奶牛，生产赖氨酸含量高的牛奶奠定基础。

背景技术

转基因动物是按人类自己的意愿有目的、有计划、有预见的改变动物的遗传组成形成的一类动物。与动物生产有关的转基因研究希望通过转基因技术来赋予动物新的遗传性状。转基因动物的制作方法目前主要有原核期胚胎的显微注射，精子载体法，ES细胞技术，体细胞核移植技术等。

赖氨酸是人体必需的8种氨基酸之一，可以调节人体代谢平衡，提高钙的吸收、加速骨骼生长，同时有促进生长发育、增加食欲、减少疾病和增强体质等作用。但是这样重要的一种氨基酸，人体自身却不能合成，必须从食物中获得。而人类主食中赖氨酸含量普遍较低，是第一限制性氨基酸。因此，寻找高赖氨酸含量外源蛋白，补充赖氨酸摄入量的不足，对于人类健康是非常重要的。牛奶中蛋白质、碳水化合物、钙、铁以及维生素等含量高，是非常优良的天然蛋白，已经作为候选蛋白在多种植物中得到表达，但是牛奶中赖氨酸的含量和比例却不能弥补谷物中赖氨酸之缺乏，满足人体对赖氨酸的需要。因此，增加牛奶蛋白中赖氨酸的含量，成为改善膳食营养的重要途径之一，也一直为科学家所关注与重视。通过转基因技术在乳腺中表达编码赖氨酸含量较高的外源蛋白，可以增加牛奶中赖氨酸的含量，补充人体必须的赖氨酸。目前，利用转基因技术已经有约100种重组蛋白在动物乳腺中得到表达，但是在乳腺中高表达赖氨酸蛋白还未见报道。

发明内容

本发明提供一种高表达赖氨酸的基因，以解决在乳腺中还没有高表达赖氨酸蛋白的问题。

本发明采取的技术方案是：该高表达赖氨酸基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述。

该高表达赖氨酸的基因编码蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所述。

本发明高赖氨酸基因的获得，包括以下步骤：

利用BioEdit生物学软件对牛奶中α-乳白蛋白、乳铁蛋白、αs-，κ-，β-，γ-酪蛋白及乳转铁蛋白中编码赖氨酸的基因片段进行比对，最终选取牛奶蛋白α-S2酪蛋白、乳转铁蛋白和β-酪蛋白中编码赖氨酸含量高的基因片段，人工合成全长376bp的高表达赖氨酸基因LR；

乳腺特异表达载体的构建：

赖氨酸基因，连入去磷酸化的乳腺特异表达载体PBC1(Invitrogen，U.S.A)的多克隆位点，构建赖氨酸基因乳腺特异表达载体(PBC1-LR)，经测序后，确定连入序列与赖氨酸基因同源性达100％，且方向正确；以真核表达载体pGK-Neo-bpa(Soriano et al.，1991；Invitrogen，U.S.A)为模板(PGK为磷酸甘油酸酯激酶启动子，以PGK启动子来驱动新霉素抗性基因neo的表达，以此来筛选转基因细胞系)，克隆出真核细胞筛选标记新霉素抗性基因(Neo)，并将其插入富含赖氨酸基因乳腺特异表达载体(PBC1-LR)，构建乳腺特异表达载体PBC1-neo-LR。

通过筛选牛奶蛋白中编码赖氨酸含量较高的基因片段，将选定的编码赖氨酸含量高的基因片段拼接，成为编码富含赖氨酸的目标基因，构建赖氨酸基因乳腺特异表达载体；再通过原核注射技术生产转基因小鼠，转基因小鼠出生后传代，最后利用聚合酶链式反应、Southern、Western印迹技术原位杂交及氨基酸成分分析确定转基因整合及表达情况。

考虑生物安全性并且为了使奶牛乳腺能特异表达外源基因，本发明选取牛奶蛋白中α-S2酪蛋白、乳转铁蛋白和β-酪蛋白三种蛋白里编码赖氨酸含量高的cDNA序列，拼接三个片段形成编码富含赖氨酸的重组目标基因(LR)，构建高效乳腺特异表达载体，为了验证此载体，利用原核注射技术获得赖氨酸转基因小鼠，旨在获得奶中表达赖氨酸含量高的蛋白产物，从而确定通过转基因技术在牛奶中表达高赖氨酸含量外源蛋白，增加提高牛奶中赖氨酸含量的可能性。高表达赖氨酸转基因载体制备可以帮助我们进一步了解哺乳动物乳腺外源蛋白特别是本研究所选赖氨酸外源蛋白的分泌机制，为赖氨酸转基因牛奶的研制奠定基础。有益效果：转基因小鼠奶中表达赖氨酸含量高的蛋白产物，使奶中赖氨酸含量显著提高。赖氨酸转基因小鼠的研究可以为我们进一步了解乳腺外源蛋白特别是本研究所选高赖氨酸含量外源蛋白的分泌机制，为转赖氨酸基因牛奶的研制奠定基础。

附图说明

图1乳腺特异表达载体、赖氨酸基因和赖氨酸蛋白结构图