[发明专利]基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法

说明书

技术领域

本发明属于一种定量分析DNA去甲基化酶的生物传感技术，具体是指DNA的去甲基化，酶切降解功能化的纳米颗粒探针，纳米颗粒的表面等离子体共振现象，纳米颗粒团聚产生的耦合增强和光吸收性质的改变。

背景技术

DNA去甲基化酶对于研究全基因组范围内的DNA去甲基化问题以及表观遗传重编排过程具有极其重要的意义。目前对于DNA去甲基化酶的检测技术有夹心免疫方法和磷32放射性同位素标记方法，洗脱步骤多，操作复杂，耗时长，灵敏度不高，试剂稳定性不好，同位素的衰变会影响结果以及放射性污染问题。

发明内容

本发明针对现有技术存在的不足，提出一种基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，不需要对酶的底物进行标记，灵敏度高，并且操作过程简便、快速。

金属纳米颗粒存在表面等离子体共振现象，当表面等离子体受到激发，在颗粒表面产生电磁场，显著增强了表面吸附分子的拉曼信号，而当纳米颗粒出现团聚时，表面等离子体发生耦合作用，在颗粒之间产生了更强的电磁场，对表面吸附分子的拉曼信号能达到10¹²倍的增强作用。

本发明的技术方案是，制备核酸功能化的纳米颗粒探针，特定的核酸序列中包含了限制性内切酶的切割位点并进行了甲基化处理，激活的DNA去甲基化酶使甲基化的DNA发生去甲基化作用，从而对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现SERS检测。同时，该方法会产生光吸收性质的变化，也可以通过比色法进行检测。

所述基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的定量分析可以通过两种技术方案来实现：

本发明的一种技术方案中，基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，包括如下步骤：

(1)制备修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针；

(2)DNA去甲基化酶使修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针发生去甲基化作用；

(3)对于甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生耦合增强，实现SERS检测；

(4)利用SERS分析技术对产物溶液进行检测。

其中，所述的甲基化DNA是包含限制性内切酶的切割位点并对该位点处的胞嘧啶进行了甲基化处理的DNA。

本发明的另一种实方式中，基于纳米颗粒团聚的DNA去甲基化酶的生物传感方法，包括如下步骤：

(1)制备修饰有甲基化DNA的纳米颗粒探针；

(2)DNA去甲基化酶使修饰有甲基化DNA的纳米颗粒探针发生去甲基化作用；

(3)对于甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶同时消化降解DNA，导致纳米颗粒团聚，产生光吸收的变化；

(4)利用紫外可见光吸收分析技术对产物溶液进行检测。

其中，所述的甲基化DNA是包含限制性内切酶的切割位点并对该位点处的胞嘧啶进行了甲基化处理的DNA。

以下对本发明做进一步的说明。

对于采用拉曼技术手段来实现对DNA去甲基化酶的定量分析，操作过程是：取修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针储备液以及缓冲溶液于微量管中，加入包含有待测物的样品溶液，37℃反应1小时后，再加入对甲基化敏感的限制性内切酶和核酸外切酶，继续在37℃反应30分钟，反应结束后，取一定体积的样品对其进行SERS检测。

本发明中，制备修饰有拉曼染料和甲基化DNA的纳米颗粒探针通过已有的标记方法来实现。具体步骤是：取0.3nM纳米金溶液1mL，10000r/min离心10min，用灭菌水定容为300μL，边搅拌边加入500μM 5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)150μL，30分钟后，再加入HS-DNA2.8nM，置于4℃冰箱；24小时后，进行第一次老化，边搅拌边加入PB(100mM，PH 7.4)57μL，10分钟后，加入PBS(10mM，含2M NaCl)30μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.1M，置于4℃冰箱；48小时后，进行第二次老化，边搅拌边加入PBS 70μL，使溶液中NaCl的终浓度达到0.3M，置于4℃冰箱；24小时后，离心洗涤三次以除去分散在溶液中的DNA，用灭菌水定容置于4℃冰箱备用。