[发明专利]一种重组禽黄病毒E蛋白及其应用

说明书

技术领域：

本发明涉及基因工程领域。具体涉及一种重组禽黄病毒E蛋白及其应用。

背景技术：

禽黄病毒（Avian Flavivirus）是2010年中国新发现的一种可引起家禽产蛋下降、采食量下降、生长迟缓及死亡的黄病毒属病毒。国内已有多位学者报道该病毒对鸭、鹅、鸡等家禽均有致病力（黄欣梅，李 银，赵冬敏等. 新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定.江苏农业学报，2011,27（2）：354-360；Jingliang Su，Shuang Li， Xudong Hu，et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new Tembusu-related Flavivirus. PLoS One. 2011, 6(3)；腾巧泱，颜丕熙，张旭等. 一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡. 中国动物床染病学报，2010,18（6）：1-4； 陈仕龙，陈少莺，王劭等. 一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定.福建农业学报，2011，26（2）：170-174）。作为一种新发疫病，该病可造成种(蛋)家禽产蛋量大幅降低甚至绝产，商品肉用家禽大批死亡，给家禽尤其是鸭鹅养殖业造成重大的经济损失。基因序列分析结果表明：禽黄病毒与黄病毒属Ntaya病毒群的坦布苏病毒（Tembusu virus）亲缘关系最高。

目前，禽黄病毒感染诊断方法主要有病毒分离法、RT-PCR、套式RT-PCR和基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR。这些方法特异性强、敏感性好，但是这些方法均需昂贵的仪器设备和试剂，且要求操作人员技术熟练。不仅不便进行大批量的临床样品的检测，而且不利于基层单位的使用和推广。血清学检测抗体可用间接ELISA方法，用纯化的全病毒作为包被抗原存在病毒培养产量低、纯化困难，生产成本太高等缺点，不利于商品化诊断试剂盒的研究和开发。

病毒的囊膜蛋白（E蛋白）是黄病毒属病毒表面最重要的结构蛋白，全长500个氨基酸左右，与病毒的嗜细胞性、毒力、血清特异性、膜融合等生物活性密切相关，是引起宿主保护性免疫反应的主要抗原。因此E蛋白可以作为检测抗体的诊断抗原应用于该病毒的血清学检测。

本发明选取禽黄病毒的囊膜蛋白（E蛋白）基因，通过克隆表达，以纯化的E蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA模式，研制出检测禽黄病毒血清抗体方法。该方法操作简单，耗时短，成本低，高通量。

发明内容：

技术问题

本发明的目的是提供一种用基因工程方法生产，可为禽黄病毒感染后特异IgG抗体检测提供成本低、特异性好的抗原，即重组禽黄病毒E蛋白。

本发明的第二个目的是提供一种重组禽黄病毒E蛋白在检测禽黄病毒感染或免疫后特异IgG抗体中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种重组禽黄病毒E蛋白在制备单抗、多抗、疫苗及蛋白芯片中的应用。

技术方案

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种编码禽黄病毒E蛋白的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。同时提供了由该重组基因序列编码的重组禽黄病毒E蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

一种重组禽黄病毒E蛋白的表达载体，它是将SEQ ID NO:1所示的重组基因序列插入到质粒pET-32a中得到的重组质粒pET-32a-E，其质粒图谱如附图1所示。将表达载体pET-32a-E导入大肠杆菌中，得到表达重组禽黄病毒E蛋白的工程菌株。

用IPTG诱导含有表达载体pET-32a-E的工程菌进行蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、纯化、复性，得到可以作为检测抗原的纯化重组禽黄病毒E蛋白。

本发明所建立的检测禽黄病毒感染后特异IgG抗体间接ELISA方法，是将重组禽黄病毒E蛋白基因克隆至表达载体pET-32a中，在大肠杆菌中表达，表达蛋白经包涵体的提取、变性、纯化、复性后用作抗原，用于间接ELISA检测动物血清抗体。

用重组禽黄病毒E蛋白制备的检测禽黄病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。该试剂盒用于间接ELISA检测动物血清抗体，操作方法包括如下步骤： 

1.          包被：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板（丹麦NUNC公司），检测孔重组禽黄病毒E蛋白包被量为4.375μg/孔，在4℃条件下过夜包被，甩干后用PBST（0.05M pH7.4 PBS +0.05%吐温-20，下同）洗涤2次；