[发明专利]一种利用酿酒酵母表达抗菌肽G13的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体的说是涉及一种利用酿酒酵母表达抗菌肽G13的方法。

背景技术

目前，由于抗生素在临床中被大量使用，所以产生了严重的耐药性问题。人类急需一种新型的药物来代替抗生素，抗菌肽是一类小分子两亲性多肽，长度一般小于50个氨基酸。来源于自然界中的各种细菌、植物和动物，分布广泛。因其抗菌机理的独特性，所以不易产生耐药性，并且具有水溶性好、热稳定性强、抗菌谱广等优点，有望成为传统抗生素的替代品。颗粒裂解肽(Granulysin)是细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK的颗粒中含有的一种阳离子抗菌肽，G13的结构域是其中含有一个a-螺旋和loop结构的肽段，由19个氨基酸残基组成，能够抑制细菌的活性，而对动物细胞没有影响，因此在医疗，畜牧，食品等领域具有广阔的发展前景。

抗菌肽的表达体系目前有以下几个来源，天然抗菌肽虽然来源广泛，但是在生物体内产量小，难于分离纯化，成本高。化学合成抗菌肽虽然周期短、工程量小、能随意组合氨基酸残基，但存在消旋化问题，并且生产成本昂贵。基因工程技术主要通过原核表达和真核表达途径，具有操作简单，易于分离和纯化，且生产成本低等特点，使其具有规模化、产业化生产的潜力，成为近些年来的研究热点。

原核表达体系以大肠杆菌表达体系为主，是目前掌握最为成熟的表达系统，其优点是生长周期短，表达产量较高，成本相对低廉。但表达抗菌肽具有以下缺点：原核表达需破碎细胞释放抗菌肽，增加了生产成本和分离纯化的难度；其持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，添加融合头融合表达虽然能够减少毒性，但需切割融合头，步骤繁琐；原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种利用酿酒酵母表达抗菌肽G13的方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种利用酿酒酵母表达抗菌肽G13的方法，其包括以下步骤：

a、提供抗菌肽G13基因和α信号肽基因，所述抗菌肽G13的基因序列为：CAAAGATCTGTTTCTAATGCTGCTACTAGAGTTTGTAGAACTGGTAGAACTGGTAGATCTAGATGGTAA，利用PCR的方法获得合成G13序列的模版和引物：所述α信号肽基因序列是以质粒pPICZ αA中的α信号肽为模版，利用PCR的方法获得α信号肽片段；

b、构建酵母细胞中表达抗菌肽G13的重组质粒pYES2-α-G13；

c、用重组质粒pYES2-α-G13转化酿酒酵母INVSC1细胞，所述重组质粒的转化方法是电转化法，采用Bio-red公司电转化仪预设PIC程序；

d、筛选转化菌，并进行鉴定，所述筛选转化菌的方法为利用酵母尿嘧啶缺陷型最小合成培养基平板培养；

e、在30℃，200rpm/min的条件下培养转化菌7～9天，获得抗菌肽G13，所述抗菌肽G13存在于培养酵母菌INVSC1的菌液上清中；

f、对抗菌肽G13进行鉴定，所述抗菌肽G13采用Tricine-SDS-PAGE作为鉴定方法。

本发明的有益效果是：本发明通过酿酒酵母分泌表达获得抗菌肽G13，表达的抗菌肽对大肠杆菌DH5α有明显的抑菌效果。采用酵母表达系统既有原核生物生长快、操作简单的优点，又有真核生物对蛋白质进行翻译后修饰的优点，酿酒酵母遗传背景清楚，易操作；酿酒酵母与日常生活密切，安全无毒素，对生物和环境都不会构成威胁；可进行蛋白翻译后加工；可进行分泌表达，具有易于纯化、工艺简单和成本较低等优点，本发明的方法对抗菌肽的真核表达研究具有重要意义。

附图说明

图1为重组质粒pYES2-α-G13的构建过程示意图；

图2为α-factor基因的PCR产物的电泳图；

图3为抗菌肽G13基因的PCR产物的电泳图；

图4为工程菌诱导上清Tricine-SDS-PAGE电泳图；

图5为工程菌诱导上清对大肠杆菌活性检测图；

在图2中，泳道M为DNA Marker D(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1为α-factor的PCR产物。

在图3中，泳道M为DNA Marker D(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)，泳道1为抗菌肽G13的PCR产物。