[发明专利]土壤中H9亚型禽流感病毒分子的检测方法

权利要求书

1.一种土壤中H9亚型禽流感病毒分子的检测方法，其步骤是：

（1）根据报道的登录号为JN381629的H9亚型禽流感病毒HA基因序列设计引物对，所述的引物对的核苷酸序列如下：

外引物-F:  5'-CTATCCAAGACGCCCAATACAC -3'；

外引物-R:  5'-CAACCAGCGACTAGCCTTGA -3'；

内引物-F:  5'- AAATACCACATTGCCATTCCAC -3'；

内引物-R:  5'- AGCCTTGACCAACCTCCCTC -3'；   

（2）待检土壤样品的处理：将同一地点不同位置所采的土壤混合，过20目分析筛，去除土壤中的石头及杂草；

（3）待检土壤样品中RNA的提取：

使用土壤RNA提取试剂盒，提取土壤中的总RNA，其步骤如下：

a、称取1 g Glass Beads I和1g Glass Beads II在15 mL离心管中，添加2.5g土壤样品；

b、加入2mL Buffer SRX至管中，涡旋1min混匀样品；

c、加入200μL Buffer DS至管中，涡旋 30 s混合样品；

d、添加1 mL水饱和酚和1 mL氯仿，速度涡旋10 min，4 ℃，4,000 × g 离心 10 min；

e、取上层水相到新的15mL离心管；

f、加入等体积的异丙醇，颠倒混匀10次，-20℃孵育10 min；

g、4 ℃，4000 × g，离心20 min；

h、去除上清，颠倒离心管放在吸水纸上干燥5min；

j、加入100μl DEPC水，并在室温下静置10min，震荡混合样品2次；

K、加入 0.9mL RNA-Solv Reagent和0.2 mL氯仿，涡旋15s；

L、4 ℃，10,000 × g，离心10 min；

M、取上层水相至新的2mL收集管中；

N、添加等体积70%V/V的乙醇混合，涡旋15s；

P、从第N步提取750μl样品到HiBind? RNA Column，插入一个2 mL收集管；

Q、10,000 × g，离心30 s，弃掉液体；

R、将HiBind? RNA Column放入上一步的收集管，并从N步开始加入剩余的样品；

S、10,000 × g ，离心30 s，弃液体和收集管；

T、将HiBind? RNA Column放入新的2mL收集管，加入500μL的RNA Wash Buffer 到HiBind? RNA Column，10,000 ×g，离心 30 s，弃液体和重复使用收集管；

W、将HiBind? RNA Column放入上一步收集管，加入750μl RNA Wash Buffer II到HiBind? RNA Column，10,000×g，离心 30 s，弃流通液体，并重新使用收集管；

X、将HiBind? RNA Column放入上一步收集管，并空离2分钟，转速> 10,000 ×g；

Y、放置HiBind? RNA Column到新的1.5 mL的离心管上，加入50μl DEPC处理水到HiBind? RNA Column膜的中心，室温静置1min；

Z、速度>14000 ×g离心1min，洗脱RNA；

（4）病毒RNA 的反转录，建立病毒RNA反转录体系：

①RNA模板3μL，引物U12 2μmol/L 1μL，dNTP 混合液各2.5mmol/L 1μL ，加DEPC水至10 μL，反应温度：65 ℃ 5 min，4 ℃ 2 min；

②5×Prime Script Buffer 4 μL , RNase 抑制剂0.5μL , Prime Script Reverse Transcriptase 200U/μL 1μL , 加DEPC水至20μL，反应温度：45 ℃ 30 min ，70 ℃ 15 min；

（5）巢式PCR扩增目的基因：

1）建立巢式PCR扩增反应体系：

第一轮PCR反应体系：2.5μL 10×Tap DNA聚合酶缓冲液，dNTP 混合液各2.5mmol/L 1μL，0.5μmol/L的外引物，0.2U的rTap DNA聚合酶，3μL cDNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL；

第二轮PCR反应体系：2.5μL 10×Tap DNA聚合酶缓冲液，dNTP 混合液各2.5mmol/L 1μL，0.5μmol/L的内引物，0.2U的rTap DNA聚合酶，3μL DNA模板，灭菌双蒸水补齐至25μL，其中阳性对照为土壤中提取的H9亚型禽流感病毒总RNA反转录后的cDNA，阴性对照为灭菌双蒸水；

2）建立巢式PCR扩增反应温度：

第一轮PCR反应温度：95 ℃ 5 min； 95℃ 20 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环；72 ℃ 5 min；

第二轮PCR反应温度：95 ℃ 5 min； 95℃ 20 s,61 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,35个循环；72 ℃ 5 min；

3）扩增产物分析：琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，琼脂糖凝胶电泳：取25μL的巢式PCR扩增的最终反应产物6μL，加入至含有0.5μg/mL 溴化乙锭染料的1.5%W/V的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察结果。