[发明专利]彩棉体细胞胚状体的萌发及成苗方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织的萌发及成苗方法，具体涉及彩棉体细胞胚状体的萌发及成苗方法。

背景技术

随着基因工程和分子生物学技术的发展，以常规育种方法为基础，以转基因技术为核心技术的现代育种技术体系，能够将外源有益基因导入棉花细胞，并使其定向而稳定的遗传，结合分子标记辅助选择技术，可以加快育种进度，提高选择效率。棉花组织培养理论和技术的发展，对于研究体细胞分化和形态建成的机理、细胞基因的表达和调控及进行遗传操作具有重要的意义。棉花组织培养具有一定的难度，通过外植体诱导体细胞胚胎萌发存在周期较长、胚发生率低、生根困难、基因型依赖性强等特点。

在棉花体细胞胚胎分化阶段主要包括：球形胚，心形胚，鱼雷胚和子叶胚等四个阶段，其中球形胚、心形胚、鱼雷前期胚均不能萌发成苗，只有子叶胚和鱼雷后期的胚可以萌发成小植株。因此选择适宜的培养基和培养条件，获得更多的子叶胚和鱼雷胚是胚性愈伤分化培养的重要目标。研究表明：棉花胚性愈伤组织成熟分化后部分体胚分化成苗，大部分胚性愈伤组织转化为非胚性愈伤组织，最终丧失体细胞胚胎的发生能力。在胚性愈伤组织发育初期，胚状体分化主要以球形胚为主，若不加入任何激素，胚性愈伤组织会一直停留在球形胚阶段，很难分化成苗，加入细胞分裂素类物质对棉花胚性愈伤组织增殖作用影响不大，但对棉花体细胞胚后期萌发有促进作用，因此棉花体细胞胚的诱导培养基中要添加不同组份的外源激素，促进胚胎萌发和分化。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，克服了彩棉外植体诱导体细胞胚胎萌发存在周期较长、胚发生率低、生根困难、基因型依赖性强的缺陷，提供了彩棉体细胞胚状体的萌发方法及成苗方法。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

彩棉体细胞胚状体的萌发方法，包括有以下步骤：

1)以彩棉下胚轴培养获得的胚性愈伤组织，通过增殖培养基继代培养1-2次；

2)将步骤1)得到的胚性愈伤组织转接至体胚诱导培养基，继代培养2-3次后，得到成熟的子叶胚。

上述彩棉体细胞胚状体的萌发方法，所述步骤2)中，体胚诱导培养基的组成为：去除NH₄NO₃的MSB培养基中加入0.1-0.3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤和0.3-0.5mg/L的吲哚丁酸，并添加1.9-3.8g/L的KNO₃、1.5-2.0g/L的植物凝胶、0.1-0.5g/L的谷氨酰胺和0.1-0.5g/L的天门冬酰胺。

本发明的第二个目的是提供了：彩棉体细胞胚状体的成苗方法，包括有以下步骤：

1)以彩棉下胚轴培养获得成熟的子叶胚转接至分化培养基上，继代培养2-3次后，分化成苗；

2)将步骤1)得到的再生苗转接至继代培养基中，20-25天继代1次，直至生根；

上述彩棉体细胞胚状体的成苗方法，所述步骤3)中，成苗培养基的组成为：1/4-1/2的MSB培养基，添加2.0-2.5g/L的植物凝胶、0.1-0.5g/L的天冬酰胺和0.1-0.5g/L的谷氨酰胺。

体细胞胚胎发生是棉花组织培养的关键步骤，如果在不加激素的培养基上持续的继代培养，理论上讲是可以实现细胞的胚胎发生，但是体细胞胚的数量很少，而且多数的胚胎会持续停留在球形胚的阶段。在成熟的体细胞胚的萌发和生长过程中，培养基中高盐分是胚状体成熟、萌发和生根最大的障碍，低盐分是棉花体细胞胚状体有效萌发的重要条件。因此，在棉花体细胞培养过程中，按照体胚培养发育阶段适当降低培养基中大量元素中盐的的浓度，才能获得良好的结果。本方法也证实了这一点，去除NH₄NO₃有利于体细胞胚胎的发生，后期有效胚胎的发生及子叶胚萌发成苗则需要降低MS中的无机盐成分。同时根据张宝红等的研究，对棉花体细胞胚胎发生具有促进作用的物质物质有IBA、ABA、IAA、BA、KT、ZT和ZiP，其效果依上述次序递增。本研究通过对IBA浓度设置梯度，证实了高浓度的IBA，低浓度的KT的组合最有利于胚性愈伤分化。

本发明的有益效果为：