[发明专利]鹅VIP基因cDNA、DNA和PHI编码序列克隆的方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是一种鹅VIP基因cDNA、DNA和PHI编码序列克隆的方法。

背景技术

繁殖性能是家禽业生产中重要的经济性状之一，但是，大多数品种的鹅都保持着较强的就巢行为，严重影响其繁殖能力。虽然家禽的就巢行为是可遗传的，通过常规选育能降低和减少其就巢行为和就巢时间，但是，由于其就巢性状的遗传力很低，常规选育方法很难彻底根除其就巢性，特别是随着选育世代的增加，遗传进展变的十分缓慢。除此，家禽就巢性还与其自身的生殖内分泌激素水平变化密切相关，近年来，国内外学者围绕家禽就巢生殖内分泌展开大量研究，阐明家禽就巢行为发生、维持和结束的内分泌机制。最终，通过常规选育结合生殖激素的调控来阻断家禽就巢行为的发生，提高其繁殖能力。

催乳素(Prolactin，PRL)是家禽就巢行为发生和维持的关键激素。Lea(1981)证明血液中高水平的PRL是引起和维持母禽就巢行为的主要原因。随后，El Halawani(1999)证明活性血管肠肽(Vasoactive Intestinal Peptide，VIP)是家禽PRL的释放因子，能促进垂体细胞分泌PRL，调控其就巢行为。并且，其他PRL调控因子(如5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(Dopamine，DA))也是通过VIP来调节PRL的分泌。由此可见，VIP在调节家禽PRL分泌和就巢行为的发生中起到至关重要的作用。

大多数哺乳动物的VIP基因序列和其结构功能都有大量报道。相对于哺乳动物，家禽的VIP基因序列研究较少，只有火鸡和鸡的VIP基因序列和结构有一些报道，鸭的VIP基因有部分片段已经克隆测序，鹅VIP基因序列和结构还未见报道。

目前，由于鹅VIP基因序列和结构还未见报道，可用的基础资料匮乏，这给运用PCR和RACE技术获得该基因cDNA、DNA和PHI编码序列带来不小困难，阻碍后续的该基因结构、功能、调控通路等研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供鹅VIP基因cDNA、DNA和PHI编码序列克隆的方法。

本发明的技术方案如下：

一种鹅VIP基因cDNA、DNA和PHI编码序列克隆的方法，用于扩展鹅VIP基因编码区部分序列的特异性引物为VIP1/VIP2，扩增鹅VIP基因cDNA5′序列的特异性巢式引物为GSP2和GSP3，3′端的特异性引物为GSP1，将测序的片段拼接，获得鹅VIP基因cDNA全长序列；用所获得的鹅VIP基因cDNA序列作为模板，设计扩增鹅VIP基因DNA序列的引物，首先筛选到VIP5/VIP6和VIP7/VIP8特异性引物，扩增出鹅VIP基因DNA两个片段，然后根据鹅VIP基因cDNA序列和所获得的DNA片段设计出VIP3/VIP4引物；结合鹅DNA中PHI样编码序列和cDNA序列，用Primer premier 5.0设计两对鹅PHI编码特异性引物PHI1/PHI2和PHI3/PHI4，用PHI特异性引物扩增鹅PHI编码序列。

所述的方法，扩展鹅VIP基因编码区部分序列的PCR反应体系及条件：PCR反应总体积为50ul，其中2×Master Mix Taq25ul，cDNA模板4ul，10μM上下游引物各1.5ul，ddH2O18ul；PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性30sec，60℃退火45sec，72℃延长45sec，从第二步开始循环38次，最后72℃延长10min。

所述的方法，扩增鹅VIP基因DNA序列的PCR反应体系及条件：PCR反应总体积为50ul，其中Premix LATaq(Takara)30ul，DNA模板1ul，上下游引物(20μM)各1ul，ddH2O17ul；PCR反应程序如下：94℃预变性5min，94℃变性1min，引物特异退火温度：VIP3/VIP4引物的退火为63℃、VIP5/VIP6和VIP7/VIP8引物的退火为60℃，退火90sec，72℃延长4min，从第二步开始循环38次，最后72℃延长20min。