[发明专利]彩棉无菌苗的培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物的培养方法，具体涉及彩棉无菌苗的培养方法。

背景技术

彩色棉作为棉花品种的一类，是重要的纯天然、无污染绿色纺织产品重要原料之一，随着人们生活水平的日益提高和纺织工业的飞速发展倍受青睐。彩色棉的纤维具有天然的棕、绿、黄、红等多种颜色，用它进行纺织可以不使用对环境有害的油剂、浆料、染料和其它后处理剂，避免了化工染料对人体的毒害作用和对棉纤维自身优良品质的破坏。但彩棉一直都受到产量低，缺乏配套加工设施，种植规模较小，作为特色棉配料进行精纺加工，生产规模受制于加工品质的制约，选育适合加工的优良品质彩色棉品种是能否推动彩色棉产业的重要条件之一。

利用现有的常规育种手段难以实现对彩色棉品种的高效改良，随着基因工程和分子生物学技术的发展，棉花转基因研究的成功突破为彩色棉的品种改良和新品种培育提供了实践依据，以常规育种为基础，进行彩色棉转基因育种技术体系研究，可以实现将外源有益基因导入彩色棉，结合分子标记辅助选择技术，可加快改善彩棉品质进程，缩短育种年限，提高选择效率。

棉花的再生一直被公认为是组织培养领域较难培育的作物之一，存在实验周期长，重复性差，对外界环境的敏感度高、基因型依赖性大等障碍因素，能否获得最佳状态的愈伤组织是棉花再生培养的关键环节。已有的研究结果表明：下胚轴作为愈伤诱导及其分化的基础材料和子叶，根等其他部位相比成功率高出许多。

发明内容

本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了彩棉无菌苗的培养方法，为彩棉再生等后续研究提供了适宜的外植体材料。

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

彩棉无菌苗的培养方法，包括以下步骤：

1)彩棉种子消毒后，以无菌水浸泡8-12小时，得到无菌彩棉种子，再将无菌彩棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS发芽培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗；

2)将步骤1)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8mm小段，并转入愈伤组织培养基中进行培养，得到彩棉的愈伤组织。

上述的彩棉无菌苗的培养方法，所述步骤1)中，光培养的光照强度为2000Lx。

上述的彩棉无菌苗的培养方法，所述步骤1)中，光暗交替条件为，先在温度30-35℃下黑暗培养3-5天，接着在温度25-28℃下光照培养2-3天，总培养时间共为5-8天。

上述的彩棉无菌苗的培养方法，所述步骤2)中，愈伤组织培养基为MSB添加有0.1mg/LN6-异戊烯腺嘌呤和0.1mg/L二氯苯氧乙酸。

外植体培养是再生的第一步，无菌苗的生长状态直接关系到愈伤组织的诱导情况。因此，本方法是在反复进行了多种暗光周期及所适应温度交替培养的试验，以期得出彩棉无菌苗的最佳培养方式，为愈伤组织的诱导提供良好的受体材料。彩棉种子的萌发，前期的黑暗时间过短，幼苗生长矮小，子叶未完全展开；黑暗时间过长不予光照，又会导致苗子过于弱小，切割后容易致死。因此，通过适宜的黑暗与光照时间培养，无菌苗可保持茁壮生长。总培养时间的确定也尤为重要，时间过短，幼苗株高较低，下胚轴粗细不匀，可切割利用的部分过少；时间过长又会造成下胚轴切割时容易连丝，脱分化能力降低，愈伤组织诱导缓慢。这可能与下胚轴幼嫩度有关，即外植体愈幼嫩，其细胞和组织分生能力愈强，脱分化能力强，老化部位脱分化能力较弱。

棉花是喜温作物，棉子发芽的最低温度为10.5-12℃，适宜温度为28-30℃，本方法中得出彩棉种子发芽的前期黑暗适宜温度为30-35℃，后期幼苗光照培养的适宜温度为25-28℃，尽管在最适温度基础上，有温度愈高种子萌发和幼苗生长愈快的说法，但考虑到恒温箱内无菌瓶内的萌发成长，温度过高易导致瓶内水汽过大，不利于苗子生长，因此这里我们不提倡高温促进生长的做法。

本发明的有益效果为：

本发明充分考虑了光培养、暗培养和温度对彩棉在无菌条件下的种子萌发及幼苗生长，通过总培养时间的确定，暗培养和光照培养各阶段时间及其对应温度的确定，获得了一个适应于无菌苗培养的成熟方法。该方法适应于彩棉品种无菌系的建立，对彩棉转基因育种具有技术支撑作用。

具体实施方式

本发明技术方案材料中提及的1/2MS发芽培养基及后期愈伤诱导的MSB培养基，均为常规培养基，配置后在高温灭菌锅灭菌后备用，MSB的成分如下：