[发明专利]燕窝酶联免疫试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及燕窝及其相关产品的检测，尤其涉及一种燕窝酶联免疫试剂盒及其检测方法。

背景技术

燕窝是由雨燕科金丝燕及同属类的唾液或者绒羽等混唾液凝结而成的巢窝，其产地分布于东南亚一带，如中国、印尼、泰国、越南和马来西亚等。燕窝是一种名贵中药，具有养阴润燥，补中益气，入胃补脾，化痰止咳等功能；燕窝含有丰富的活性糖蛋白，钙、铁、磷、碘及维生素等天然营养物和矿物质，还具有的防止流感病毒，促进细胞生长和加强免疫系统功能等作用。由于燕窝的营养价值和经济价值均较高，而且消费者对其需求日益增长，因此一些商贩通过染色、漂白，或以银耳、猪皮、琼脂、果胶等掺假伪造。假冒伪劣的燕窝及其制品频繁被曝光，而检测燕窝及其相关产品的标准方法尚属空白，因此，为保障消费者的合法权益和生命健康，完善市场秩序，完善燕窝及其相关产品的检测方法迫在眉睫。

现有的燕窝及其相关产品检测方法主要有：

（1）PCR方法：利用燕窝中特定基因片段进行PCR检测，该方法特异性好；但无法做到定量检测，而且燕窝制成品往往需要热加工，容易导致样品中DNA降解，从而使检测结果出现假阴性；

（2）电泳方法：基于燕窝蛋白质图谱进行分析，但抗基质干扰能力差，灵敏度低，仅限于对燕盏进行检测，无法用于燕窝制成品的检测；

（3）特定组份分析法：利用色谱、光谱等手段，通过分析燕窝中各种化学组份如特定元素、氨基酸、唾液酸、糖类等的含量鉴定其真假，但其特异性不高，易于被人为添加物干扰。

因此，现有的检测技术存在特异性不强，容易受人为添加物的干扰，无法进行定量分析，适用范围窄，无法对燕窝含量不高、需高温加工且基质干扰较大的燕窝制成品进行有效的检测，检测操作繁琐，检测时间长，需要配备大型分析仪器且要求专业的操作人员等缺点。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人预料不到地发现，通过提取唾液酸糖蛋白作为抗原，制备高度特异的抗燕窝唾液酸糖蛋白抗体，构建的酶联免疫试剂盒可广泛应用于燕窝及其相关产品的检测，且具有特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，可进行定量检测，检测结果准确性好，操作简单、快捷，检测成本低等优点。

本发明提供一种燕窝酶联免疫试剂盒，包括唾液酸糖蛋白标准液、抗唾液酸糖蛋白抗体、酶标二抗、酶标板和底物显色液。上述试剂均以工作液的形式提供，其中唾液酸糖蛋白标准液包括系列梯度浓度的唾液酸糖蛋白标准液，有利于减少使用者的实验步骤，从而减小误差。

采用上述技术方案，可对燕窝及其相关产品进行高通量的定量检测，使用方便，特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测成本低。

作为本发明的进一步改进，所述酶标二抗采用羊抗鼠IgG-HRP，购自武汉博士德，使用0.01M pH7.4的PBS以1:10000稀释配成酶标二抗工作液。

作为本发明的进一步改进，所述酶标板包被了唾液酸糖蛋白抗原。所述酶标板通过将唾液酸糖蛋白抗原加入高吸附酶标板，包被过夜，5%脱脂奶粉封闭后真空干燥获得。此外，也可将抗唾液酸糖蛋白抗体加入高吸附酶标板，包被过夜，5%脱脂奶粉封闭后真空干燥获得包被了抗唾液酸糖蛋白抗体的酶标板。

作为本发明的进一步改进，所述底物显色液由显色剂A和显色剂B组成，所述显色剂A采用双氧水，所述显色剂B采用四甲基联苯胺。

作为本发明的进一步改进，燕窝酶联免疫试剂盒还包括洗涤液、稀释液和终止液，所述洗涤液为pH7.4 的PBST（由PBS中加入吐温-20获得），所述稀释液为pH7.4 的PBS，所述终止液采用硫酸，上述试剂均以工作液的形式提供，可方便地进行现场检测和大量样本的筛查，也利于提供检测结果的准确性。

本发明还提供燕窝酶联免疫试剂盒的检测方法，包括如下步骤：

A） 样品前处理：将样品均质，加入PBS超声提取，离心，取上清液稀释后得到样品溶液；

B） 往包被了唾液酸糖蛋白抗原的酶标板的相应微孔中加入系列梯度浓度的唾液酸糖蛋白标准液或样品溶液，加入抗唾液酸糖蛋白抗体，孵育后洗涤、拍干，加入酶标二抗，孵育后洗涤、拍干，加入底物显色液，孵育后加入终止液，用酶标仪测定OD值；

C） 建立标准曲线，对样品溶液的检测结果进行分析。