[发明专利]人精氨酸酶和聚乙二醇化人精氨酸酶及其应用

权利要求书

1.一种精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶为人精氨酸酶I，其由SEQID NO.1定义的氨基酸序列中第45，168和303位的半胱氨酸中的一个、两个或三个突变为非极性氨基酸。

2.权利要求1所述的精氨酸酶，其中所述第45，168和303位的半胱氨酸独立突变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或脯氨酸，最优选的，突变为丙氨酸。

3.权利要求1或2所述的精氨酸酶，其特征在于：

（1）所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的一个发生突变，优选的，第303位半胱氨酸突变，更优选的，突变为丙氨酸；

（2）所述精氨酸酶的第45，168和303位的半胱氨酸中的任意两个发生突变，例如第45位和第303位半胱氨酸突变，第168位和第303位突变，或第168位和第45位突变，优选突变为丙氨酸；或

（3）所述精氨酸酶的第45位、第168位和第303位半胱氨酸突变，优选突变为丙氨酸。

4.权利要求1-3中任一项的精氨酸酶，其中所述精氨酸酶的活性为至少大约500U/mg，优选至少大约700U/mg，最优选至少大约800U/mg。

5.一种聚乙二醇化的精氨酸酶，其特征在于，所述精氨酸酶如权利要求1-5中任一项定义，并经过聚乙二醇化修饰与聚乙二醇（PEG）分子结合。

6.权利要求5所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中每分子所述聚乙二醇化的精氨酸酶结合的聚乙二醇分子的总分子量为约20-70K，优选为约30-60K。

7.权利要求5或6所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述聚乙二醇分子的平均分子量为约2-40K，优选为5-20K、最优选为约5K。 

8.权利要求5-7中任一项所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述聚乙二醇化是通过聚乙二醇修饰剂将聚乙二醇分子与精氨酸酶上的基团共价结合，所述聚乙二醇修饰剂包括与蛋白表面赖氨酸或N-端的ε-NH2或α-NH2结合的聚乙二醇修饰剂、与蛋白质上氨基酸的巯基或羧基偶联的聚乙二醇修饰剂，优选的，其中所述聚乙二醇修饰剂选自甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯（mPEG-SPA），mPEG-琥珀酰亚胺丁酸酯（mPEG-SBA），mPEG-琥珀酰亚胺琥珀酸酯（mPEG-SS），mPEG-琥珀酰亚胺碳酸酯（mPEG-SC），mPEG-戊二酸单酯-羟基琥珀酰亚胺酯（mPEG-SG），mPEG-酰胺-琥珀酸亚胺酯（mPEG-NHS），mPEG-三氟乙基磺酸酯(mPEG tresylate)和mPEG-醛(mPEG aldehyde)，更优选的，其中所述聚乙二醇修饰剂为甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯，优选为甲氧基聚乙二醇丙酸琥珀酰亚胺酯5000。

9.权利要求5-8中任一项所述的聚乙二醇化的精氨酸酶，其特征在于：

（1）其中所述精氨酸酶在SEQ ID NO.1定义的氨基酸序列第45，168和303位的半胱氨酸中的任意两个发生突变，各自独立突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更优选突变为丙氨酸，其中精氨酸酶结合的PEG分子平均分子量为5K，每分子聚乙二醇化的精氨酸酶带有的聚乙二醇分子为约4-13个，优选为6-12个；

或

（2）其中所述精氨酸酶在SEQ ID NO.1定义的氨基酸序列第45，168和303位的半胱氨酸各自独立突变为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸，更优选突变为丙氨酸，其中精氨酸酶结合的PEG分子平均分子量为5K，每分子聚乙二醇化的精氨酸酶带有的聚乙二醇分子为约4-13个，优选为6-12个。

10.权利要求5-9中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述精氨酸酶在血液或血清中的半衰期为至少0.5天，优选至少2.5天，最优选至少3.5天。

11.制备权利要求1-4中任一项的精氨酸酶或权利要求5-10中任一项的 聚乙二醇化的精氨酸酶的方法。

12.权利要求1-4中任一项的精氨酸酶或权利要求5-10中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶在治疗与精氨酸酶有关的疾病的药物中的用途，优选的，所述疾病选自高精氨酸血症和精氨酸依赖性的细胞增生或肿瘤，例如肝癌，黑色素细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌或白血病。

13.一种治疗与精氨酸酶有关的疾病的药物组合物，其中含有权利要求1-4中任一项的精氨酸酶或权利要求5-10中任一项的聚乙二醇化的精氨酸酶，其中所述疾病选自高精氨酸血症和精氨酸依赖性的细胞增生或肿瘤，例如肝癌，黑色素细胞瘤，乳腺癌，小细胞肺癌，前列腺癌，淋巴癌或白血病。