[发明专利]一种基因合成方法、基因芯片及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及基因芯片领域，具体公开了一种高通量、高保真、基因合成方法、基因芯片及试剂盒。

背景技术

合成生物学的一个关键技术问题是低成本、高通量的基因合成和蛋白质表达的精确调控。目前，人工合成基因的主要方法是将短链的寡核苷酸进行拼接和组装得到长链的DNA。使用化学方法人工合成短链寡核苷酸的方法成本高，每核苷酸约需人民币0.6元，且合成错误率高，100个碱基中出现一个碱基缺失，400个碱基中约有一个碱基错配和插入。因此，利用寡核苷酸组装来合成基因或基因组的成本十分昂贵，且合成累积的错误率很高。通过克隆测序和突变的方法来修复错误会进一步增加工作量和总成本。

在微流芯片上进行大规模平行合成寡核苷酸合成可以显著的降低成本。目前，在芯片上合成寡核苷酸的方法主要包括喷墨打印(Agilent公司)、5’端修饰光敏保护基团(Nimblegen/Affmetrix公司)，光照生成酸脱保护(Atactic/Xeotron)和电化学方法(Oxamer/Combimatrix公司)。但是，由于微流芯片的表面积非常小，寡核苷酸合成产量低，溶液中每种序列的寡核苷酸浓度为10^-12摩尔或更低，因此，在组装成基因之前还需进行大量扩增。目前可行的方法是通过化学或酶解处理将合成出的寡核苷酸从微流芯片上释放下来，经PCR扩增、限制性酶消化和纯化后，得到的寡核苷酸用来组装成基因或基因组，而合成基因的错误修复方法主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳、高效液相色谱分离。因此，目前基因合成和错误修复的步骤依然繁琐，迫切需要提高其集成化、微型化程度，显著降低成本，并提高合成和错误修复效率。

发明内容

本发明旨在提供一种高通量、高保真、低成本的基因合成方法，将扩增寡核苷酸库和平行组装基因步骤整合到一块微流芯片上同时进行；采用错配特异性内切酶建立高效的基因合成错误修复体系，使合成错误率由每千碱基对(kb)约1.9个错误碱基降至低于0.19个错误碱基，成本为目前报道最低成本的十分之一。

本发明提供的一种基因合成方法，在一张基因芯片上采用恒温刻痕和链位移扩增及聚合酶拼接反应进行寡核苷酸扩增以及基因组装，所述基因芯片通过将寡核苷酸固定在固相载体表面形成，寡核苷酸的3’端具有长度为15-150个碱基的接头序列且通过该接头序列中的刻痕内切酶识别位点锚定在芯片表面。

优选地，所合成基因的长度大于或等于200个碱基对。

优选地，还包含并采用错配特异性内切酶进行基因合成错误修复步骤。

优选地，寡核苷酸扩增以及组装、基因合成错误修复三种反应在同一体系中先后连续进行或分步进行。

优选地，基因合成错误修复反应在芯片上或芯片外单独进行。

优选地，所述基因芯片可以划分成一个或多个区域，寡核苷酸扩增以及基因组装在一个或多个区域同时进行。

优选地，所述恒温刻痕和链位移扩增及聚合酶拼接反应是采用一条通用引物与寡核苷酸3’端的接头杂交，在链移位聚合酶延伸并位移寡核苷酸链的同时，刻痕内切酶将通用引物从刚刚扩增出的寡核苷酸链上裂解下来，使通用引物的3’端重新游离，继续开始新的延伸反应。

优选地，所述基因合成错误修复步骤为：通过热变性，让合成的基因重新退火，使错配位点暴露，错配位点被错配特异性核酸内切酶和3’→5’核酸外切酶活性识别并切除，所得的基因片段经交叠延伸PCR反应组装成完整基因。

本发明的另一个目的是提供一种基因芯片，所述基因芯片通过将寡核苷酸探针固定在固相载体表面形成，寡核苷酸的3’端具有长度为15-150个碱基的接头序列且通过该接头序列中的刻痕内切酶识别位点锚定在芯片表面。

优选地，所述基因芯片采用物理区隔的办法，将微阵列分为子阵列，每一个子阵列中包含合成大于0.2kb总长的寡核苷酸序列。

本发明的基因芯片所采用的固相载体选自任何可用于制备基因芯片的材料，包括但不限于，硝酸纤维素膜、尼龙膜、玻璃片、硅片和塑料片。本发明所述基因芯片的制备，是将所述的寡核苷酸有序地点样到载体上，通过寡核苷酸的3’端接头序列中的刻痕内切酶识别位点锚定，将寡核苷酸固定于载体上，从而制成基因芯片。

本发明还提供一种基因合成的试剂盒，包含上述任一项所述基因芯片、刻痕内切酶、链位移DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶以及错配特异性内切酶。