[发明专利]利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法。

背景技术

视网膜变性疾病是一类严重的致盲性疾病，主要包括视网膜色素变性(Retinal pigment degeneration，简称RP)和年龄相关性黄斑变性(Agerelated macular degeneration，简称AMD)等。此类疾病发病机理不明、有效防治手段有限，严重危害患者的生活质量，每年在全球范围内造成数千亿计的巨大损失。此类疾病的病理过程均是因视网膜色素上皮细胞(Retinal pigment epithelium，简称RPE)的变性死亡所引致。故应用RPE细胞进行替代性移植治疗成为治疗此类疾病的重要手段，但RPE细胞来源有限，限制了移植治疗的临床应用。

目前人胚胎干细胞诱导分化的RPE细胞成为了细胞移植治疗的研究热点，已有大量离体及在体实验证明该细胞具有类似甚至优于原代分离的人的RPE细胞。但胚胎干细胞用于人体仍然存在伦理和免疫排斥的问题，且胚胎干细胞诱导分化成色素上皮细胞存在分化效率较低、时间较长等不足。

近年来，为寻找自体来源的细胞有人尝试将人脂肪间充质干细胞在离体条件下诱导分化为RPE细胞，采用的方法是通过离心获取原代培养一周的RPE细胞的培养液上清作为条件培养液诱导人脂肪间充质干细胞进行分化，该方法诱导出的细胞具有RPE细胞的表型，但不具备RPE细胞典型的色素颗粒，也还尚未对该细胞进行功能学的检测，另外，离心获取的条件培养液仍可能混有原代细胞而导致细胞混杂污染。

因此，需要一种诱导分化自体来源细胞为RPE细胞的方法，使分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的重要表型和生理功能，而且分化时间短、分化效率高、在培养过程中无诱导细胞的混杂污染。

发明内容

鉴于此，本发明的目的是提供一种人的骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，简称MSC)诱导分化为视网膜色素上皮细胞(RPE)的方法，分化的RPE细胞具有原代RPE细胞的重要表型和生理功能，而且分化时间短、分化效率高、在培养过程中无诱导细胞的混杂污染。

本发明提供了一种利用人骨髓间充质干细胞制备视网膜色素上皮细胞的方法，将人骨髓间充质干细胞与视网膜色素上皮细胞非接触式共培养诱导所述人骨髓间充质干细胞分化。

优选的，所述非接触式共培养采用的视网膜色素上皮细胞为原代视网膜色素上皮细胞；视网膜色素上皮细胞的原代细胞比传代细胞具有更强的蛋白表达及分泌能力，比如视网膜色素上皮细胞的第3代传代细胞几乎丧失了表达诸如RPE65蛋白等重要功能蛋白的能力。

优选的，所述非接触式共培养包括如下步骤：

a.接种人骨髓间充质干细胞于细胞培养孔板中，加入培养液，放置培养至细胞贴壁，弃孔板中的培养液；

b.接种视网膜色素上皮细胞于Transwell小室中；

c.将步骤b中的Transwell小室置于步骤a中的孔板中，加入培养液，形成非接触式共培养体系，放置培养，并定期更换培养液至细胞分化；

d.将步骤c中分化的细胞进行消化传代。Transwell小室是一类有通透性的杯状的装置，杯子底层有一张通透性膜，膜上有微孔，孔径大小有0.1-12.0μm，而杯子其余部分材料与普通孔板相同。将Transwell小室放入细胞培养孔板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以膜相隔。培养于普通培养板中的原代RPE细胞在离体培养一周后蛋白表达及分泌能力急剧下降，而极性生长于膜上的RPE细胞相比培养于塑料培养板中的RPE细胞能更好的维持蛋白表达和分泌各种因子的能力，即微孔膜能够为RPE细胞的极性生长提供良好的基础，因此采用Transwell小室具有较传统培养方式收集的条件培养液更好的诱导分化微环境。本发明采用Transwell小室的非接触式共培养的培养方式为人MSC提供了定向分化微环境，且避免了诱导细胞的混杂污染。

优选的，步骤a中：所述人骨髓间充质干细胞采用第3-6代传代细胞；所述接种人骨髓间充质干细胞采用的接种密度为每孔2×10⁴细胞；所述培养液为含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液。