[发明专利]一株微嗜酸寡养单胞菌及其在防治苹果树腐烂病中的应用

说明书

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于苹果树腐烂病菌生物防治的细菌的分类鉴定、发酵液的制备方法及对苹果树腐烂病的防治。 

背景技术

苹果是我国的重要经济作物和出口水果，栽培面积和产量均居世界首位。然而，病害却严重制约着我国苹果产业的发展，特别是苹果树腐烂病(Valsa ceratosperma)在我国分布广、危害重、防治难，果农称之为苹果树“癌症”。腐烂病菌具有潜伏侵染特性，一旦条件适宜染病部位树皮迅速腐烂坏死、树势衰退、降低苹果产量和品质，严重时可引起主干及整树死亡，甚至造成毁园(陈策，2009；陈策等，1987)。自1916年苹果树腐烂病在辽宁省南部地区发现以来，该病已在我国有过几次大流行，造成大面积果树死亡。随着我国苹果产业种植结构的调整，现在主栽的苹果品种几乎均对腐烂病菌敏感。2008年，国家苹果产业技术体系调查显示，全国范围内苹果腐烂病的总体发生率高达52.7％；2011年，对栖霞等地腐烂病的发生严重程度进行了调查，结果表明，所调查果园具有新病疤的病株率为68.20％，死株率为2.76％，总体发病情况比一般年份严重(曹克强等，2009；王彩霞等，2012)。 

苹果是多年生木本植物，难以通过栽培坑病品种解决病害问题，且苹果树腐烂病具有逐年累积，连续危害的特点。目前，对于苹果树腐烂病等病害的防控主要依靠化学药剂，因此，苹果果园用药量比大田作物要高出几倍到十几倍。长期大量使用化学农药不仅会严重污染环境，造成对非靶标生物的有害影响，使果园生态环境恶化，同时也会增加腐烂病菌的突变几率，导致抗、耐药性菌株的大量增加。因此，寻找新的、安全有效的措施来防治苹果树腐烂病显得尤为迫切和重要。 

利用生防菌防治植物病害在国内外均有相关报道，经检索，申请者在现有的专利和非专利文献中没有检索到微嗜酸寡养单胞菌用于苹果树腐烂病生物防治的相关文献报道和专利。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种针对由黑腐皮壳菌(Valsa ceratosperma)引起的苹果树腐烂病具有显著生物防治效果的微嗜酸寡养单胞菌菌株；将其制备为生防菌剂，用来防治苹果树腐烂病。以此减少化学 药剂的使用次数和使用量，消弱其对环境的破坏以及对人类身体健康的影响，并可延迟苹果树腐烂病菌抗、耐药菌株的出现，以实现苹果产业向着安全、高效、可持续的方向发展。 

本发明通过以下技术方案实现： 

本发明从山东省苹果主产区栖霞市商品苹果园的根际土壤中分离筛选获得一株用于苹果树腐烂病生物防治的细菌菌株BJ1，经形态学、生理生化特性及16S rDNA序列分析鉴定为微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)，该菌株已于2011年12月23日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(英文简称CCTCC)，其保藏号为：CCTCC NO：M2011475。 

申请人利用液体发酵的方法制备了一种对苹果树腐烂病具有防治作用的微生物菌剂，其步骤如下： 

1)培养基的制备： 

NA培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，琼脂粉15.0g，加水定容至1000mL，pH值7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min； 

NB培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，NaCl 5.0g，加水定容至1000mL，pH值7.0，分装于250mL三角瓶中，装瓶量为80mL，121℃高压蒸汽灭菌20min； 

2)BJ1菌株的活化：先将保存的生防菌微嗜酸寡养单胞菌BJ1接种在上述NA培养基中，于30℃恒温培养箱中活化24h； 

3)BJ1菌株的液体培养：挑取步骤2)中活化的微嗜酸寡养单胞菌BJ1菌株的单菌落，接种于装瓶量为80mL/250mL的NB培养基中，180r.min^-1，30℃恒温振荡培养48h，得到浓度为10⁷cfu.mL^-1的BJ1菌株的细胞培养液； 

4)BJ1生防制剂的制备：将步骤3)中制备的细胞培养液，在4℃条件下，12000r.min^-1离心20min，收集上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，上清液即为无菌发酵滤液； 

5)稀释：将步骤4)中制备的无菌发酵滤液稀释0-100倍。 

本发明的有益效果是：