[发明专利]一种生物分子的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物分子的定量检测方法，具体是一种基于核酸杂交链式反应的生物分子的定量检测方法。

背景技术

对核酸、蛋白质等重要生命物质进行高灵敏度和高选择性检测对于深入揭示其生物功能以及疾病诊断等研究领域都具有十分重要的意义。以核酸分析为例，一些重要的核酸片段往往在人体内含量极低，若实现高灵敏度和特异性检测，通常要用到扩增技术。核酸扩增技术主要可分为两大类：温度循环扩增和恒温扩增。聚合酶链式反应(PCR)是目前应用最为广泛的温度循环核酸扩增技术，反应指数进行，痕量的核酸分子能够被扩增到可以检测的水平。另一种常用的热循环扩增技术是连接酶链式反应(LCR)，在温度循环过程中连接反应的产物成为下一个循环的反应物，因此反应的产物在温度循环过程中呈指数增加。然而，基于热循环的核酸扩增技术一般都需要较长的时间，反应过程受限于热稳定性的酶，需要精准的控温，有时特异性也较差。近年来，以滚环扩增(RCA)技术为代表的恒温扩增方法由于可摆脱精准控温和热循环的限制而得到了长足发展。但与热循环扩增类似，RCA等恒温扩增过程也必须在一种或多种酶的共同作用下才能完成，使得这些扩增技术都强烈地依赖于所用酶的活性和稳定性。

杂交链式反应(Hybridization Chain Reaction，HCR)给核酸扩增技术带来了新的突破，该技术无需任何酶的催化作用，是依靠杂交反应的热力学和动力学原理设计的恒温扩增方法。HCR反应体系需要两种亚稳态的茎-环结构核酸探针(简称为H1和H2)，所谓亚稳态结构是指当没有靶标引发分子时，H1和H2单体能够各自稳定地共存于溶液中，并不发生反应。但当加入起始物靶标引发分子之后，H1和H2单体分子会在靶分子作用下依次循环的打开从而聚合成带微缺口的长链双螺旋核酸结构，实现对靶标分子的恒温扩增。由于HCR可实现无酶催化恒温扩增，反应条件简单，摆脱了常规扩增技术对酶稳定性和精确控温等条件的依赖，在核酸研究领域展现出了独特的优势。但是，如何通过对HCR产物进行分析并进而给出起始靶标分子的定量信息，目前仍缺乏灵敏、有效的手段。目前已有报道的检测HCR产物的方法主要有凝胶电泳和荧光标记方法，凝胶电泳检测方法灵敏度低，无法满足痕量生物分子的分析要求；Tan等人(Angew.Chem.Int.Ed.，2011，50，401-404)在H1及H2探针的两个末端分别标记上Pyrene荧光分子，HCR反应后会形成Pyrene二聚体，其荧光发射波长和强度与H1或H2单体相比有明显变化，因此可通过二聚体的荧光信息实现对起始引发分子的定量分析。但该技术需要在每条核酸探针的两个末端都进行荧光分子标记，步骤繁琐，成本较高。但是，若不采用荧光二聚体技术，而在每个H1或H2单体上进行常规单荧光分子标记，则HCR反应前后体系的荧光信号不存在差异，无法实现对HCR产物的区分。

发明内容

本发明的目的是提供一种成本低、灵敏度高，且操作简单的生物分子的定量检测方法。

本发明的目的通过以下技术方案得以实现：

本发明所提供的生物分子的定量检测方法，包括以下步骤：

(a)依据靶标生物分子序列，设计荧光标记的H1*和H2*探针；

(b)将设定浓度的、标记有荧光基团的茎-环结构核酸探针H1*和H2*溶液分别置于PCR仪上95℃条件下加热2分钟，然后在室温下避光放置1～2小时，使茎环结构充分闭合；

(c)将靶标生物分子用灭菌水或缓冲液配制成设定规格浓度的生物分子溶液；取数个离心管，分别在各个管中加入不同规格浓度的生物分子溶液，同时分别加入b步所制备的H1*、H2*溶液，混合均匀后在室温下进行HCR反应；

(d)待HCR反应结束后，根据步骤(b)中H1*和H2*的溶液浓度，每个离心管中加入适量的碳材料，使碳材料的用量刚好能够完全猝灭初始浓度H1*和H2*单体的荧光信号，室温反应30分钟后，检测并记录体系的荧光信号；

(e)通过荧光信号对靶标生物分子进行定量分析。

本发明方法所涉的茎-环探针单体均采用常规单荧光分子标记(H1*，H2*)，在靶标物质存在时发生HCR形成富集众多荧光基团的长链带微缺口的双螺旋核酸结构；在反应体系中加入碳材料用来区分HCR前后的荧光信号差异。所用碳材料能高效猝灭H1*和H2*单体的荧光信号，但对HCR产物双螺旋核酸结构上面的荧光基团猝灭作用显著降低。因此，体系中靶标生物分子含量越高，形成的HCR产物双链越多，加入碳材料后体系的荧光信号就越强，从而可实现靶标生物分子的定量检测。

本发明中所述的：