[发明专利]一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法

说明书

技术领域

本发明属于分离纯化领域，特别涉及一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法。

背景技术

从特殊生物资源中发现先导化合物是目前国际药物研究的重要方向。海洋是人类可持续发展的重要战略空间与资源库。海洋微生物由于环境的特殊性以及在海洋生态系统中的功能，发展出了一些独特代谢的方式，从而可以产生极其丰富的、结构多样与新颖的代谢产物，为创新药物的研究与开发提供了大量的新型药物先导化合物模式结构。

随着近年来海洋微生物培养技术和分子生物学技术的发展，从海洋中分离到了大量新的微生物，并且从中分离出了许多具有生物活性的的次级代谢产物。其中，由E.B.G.Jones与L.L.P.Vrijmoed等人在中国南海红树林树叶内分离得到的内生真菌Halorosellinia sp.1403，经过培养后，可以从其发酵液中分离出多种活性产物，包括灰黄霉素和多种蒽醌、萘醌和咕吨酮类等物质，这些化合物大多具有抗肿瘤、抗菌活性(肖娜娜.固体发酵两株南海红树林内生真菌的次级代谢产物研究.中山大学硕士学位论文.2010)。

1403C是从Halorosellinia sp.1403的培养液中分离出的结构新颖的蒽醌类化合物(姜广策，林永成等.中国南海红树林内生真菌No.1403次级代谢物的研究.中山大学学报，2000，39(6)：68-72)。经过中山大学对其进行的活性测试，确定其具有较好的抗肿瘤活性(佘志刚，林永成等.一类醌类化合物及其制备方法与抗肿瘤应用.ZL200610035637.X)。因此该化合物具有良好的应用前景。

目前已报道的1403C的制备方法为生物发酵法，包括发酵培养与分离纯化两个制备环节。1403C的发酵培养方法已有较多报道，包括培养基的配方、培养条件、接种方法、补料方法等。

1403C的分离纯化方法目前采用的是萃取--硅胶/聚酰胺层析--重结晶的方法，如专利ZL200610035637.X报道，将发酵液固液分离后除去菌体，加热浓缩至原体积的1/3-1/5，用乙酸乙酯反复萃取、浓缩，在硅胶柱中进行层析分离，用石油醚/乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，收集50％--100％乙酸乙酯/石油醚部分，浓缩后再经聚酰胺柱层析，70％乙酸乙酯/石油醚洗脱，重结晶纯化，得到红色1403C晶体。

采用已知的方法进行1403C分离纯化，步骤繁琐、操作困难，工艺不稳定；所用的有机溶剂挥发性和毒性均较强、用量较大，生产过程的污染大、安全性差，不利于工业化的生产操作。

发明内容

本发明提供一种从发酵液中分离纯化高纯度1403C的方法，该方法操作更简单易控、工艺稳定性强；生产过程的污染小、安全性高，更加利于工业化的生产操作。

本发明采用的技术方案如下：一种从1403C的发酵液中分离纯化1403C的方法，包括以下步骤：

1)在1403C的发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节pH至pH 1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，然后固液分离取液相，得到抽提液；

2)将步骤1)所得的抽提液浓缩后用非极性吸附剂吸附，经吸附过的液体用高效液相色谱检测，收集1403C峰纯度90％以上的部分，得到纯化液；

3)将步骤2)所得的纯化液浓缩后在-20℃到25℃的环境中析晶，取晶体即得1403C。

本发明中，步骤1)为：在1403C的发酵液中加入极性有机溶剂或极性有机溶剂和水的混合物，调节pH至pH 1-4，50℃-75℃搅拌0.5-2小时，然后固液分离取液相，得到抽提液。

本发明所述的1403C的发酵液可以是任何能够产生1403C的菌体的发酵液，只要该菌体能够产生1403C即可。如可以由红树林内生真菌Halorosellinia sp.1403经培养后获得，该发酵液的制备方法已公开在专利201010179396.2、200910199117.6、以及文献“中国南海红树内生真菌No.1403次级代谢物的研究”、“七种南海海洋真菌和放线菌代谢产物的研究”中。Halorosellinia sp.1403的菌种在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)有保藏，保藏号：M201018。