[发明专利]一种连续流动巢式PCR微流控方法

权利要求书

1.一种连续流动巢式PCR微流控方法，包括如下步骤：

1）提取待测样本的基因组DNA；

2）引物设计：针对目标检测物的特异性基因DNA序列设计由一对外引物和一对内引物构成的巢式引物；

3）配制PCR反应体系：第一轮PCR反应体系含有外引物；第二轮PCR反应体系含有内引物；

4）第一轮PCR反应：将待测物的DNA样品加入第一轮PCR反应体系中，得到第一轮PCR反应液，将第一轮PCR反应液注入连续流动巢式PCR微流控装置中，完成20~35个PCR热循环；

5）第二轮PCR反应：取部分第一轮PCR扩增产物加入第二轮PCR反应体系中，充分混匀后，得到第二轮PCR反应液，将第二轮PCR反应液注入连续流动巢式PCR微流控装置中，完成20~35个PCR热循环。

2.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：第一轮PCR反应体系包括：

组分                           终浓度

Taq 聚合酶                 0.05~0.1U/μL

Tris-HCl（pH=8.3）    10 mM

KCl                            50 mM

MgCl₂                               1.5 mM

4×dNTP Mixture        0.2 mM

外引物1                    200~300 nM

外引物2                    200~300 nM

第二轮PCR反应体系包括：

组分                           终浓度

Taq 聚合酶                0.05~0.1 U/μL

Tris-HCl（pH=8.3）    10 mM

KCl                            50 mM

MgCl₂                               1.5 mM

4×dNTP Mixture        0.2 mM

内引物1                     300~400 nM

内引物2                     300~400 nM。

3.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：第一轮PCR反应的条件为：20 ~ 35个PCR扩增循环，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的流通时间分别为4~10 s、4~10 s和4~22 s。

4.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：第二轮PCR反应的条件为：20 ~ 35个PCR扩增循环，每个PCR扩增循环中，PCR反应液在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的流通时间分别为4 ~ 10 s、4 ~15 s和10 ~ 22 s。

5.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR过程是在连续流动的单一液相体系中完成的。

6.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR的变性、退火和延伸是以PCR反应混合液反复依次流过解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的形式实现。

7.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的停留时间是通过调节PCR反应混合液在反应通道中线性流速来控制的。

8.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的停留时间之比是由反应通道在解链恒温区、退火恒温区和延伸恒温区的长度之比决定。

9.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR反应体积可根据待测样品的量在5~50 μL之间灵活可调。

10.根据权利要求1所述的连续流动巢式PCR微流控方法，其特征在于：巢式PCR反应是在开放通道中单向流动过程中实现。