[发明专利]一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒

权利要求书

1.一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，其特征在于，具体包括以下制备步骤：

1）制备PDA培养基：称取去皮洗净的马铃薯100 g，放入500 mL蒸馏水中，将水煮沸至100 ℃并保持30分钟，过滤，加入10 g琼脂粉，补足水至1000 mL，调pH值至7.0，分装后高压灭菌，4 ℃保温贮存备用；

2）培养菌种：将黄曲霉接种于马铃薯固体培养基（PDA）上，28 ℃培养； 

3）设置环媒恒温基因扩增（LAMP）引物；

4）提取真菌DNA模板；

5）将模板、引物、dNTP和缓冲液等反应试剂按比例配制加入PCR管，将反应体系至于63 ℃的温度条件下保温60 min，其后在80 ℃下热浴3分钟灭活BstDNA聚合酶，反应终止，产物于2.0%琼脂糖凝胶中电泳；

6）参考株DNA提取液作模板，采用25μL反应体系，分别改变反应温度、反应时间、Mg²⁺的浓度、dNTP的浓度、Betaine的浓度，分别进行LAMP反应，用琼脂糖凝胶电泳判断LAMP结果，以选择最好的扩增条件；

7）用LAMP 检测法扩增黄曲霉，凝胶电泳成像检查扩增产物，判断该试验的特异性；

8）以上制备的模板作10n倍比稀释，分别取各稀释度1 μL进行LAMP扩增，结合饲料中霉菌总数的测定方法(GB/T13092-2006)，以MPN法测定所挑取的菌液浓度；

9）按照上述方法建立黄曲霉素真菌检测试剂盒。

2.根据权利要求1所述的一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，其特征在于，所述凝胶用溴化乙锭染色，用以方便紫外线透射观察。

3.根据权利要求1所述的一种基于环媒恒温基因扩增法的黄曲霉素检测试剂盒，其特征在于，所述黄曲霉素真菌检测试剂盒可用SYBR Green I判断法和凝胶电泳成像法判断样品检测结果。