[发明专利]一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其检测方法和其应用。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病最主要的贮存宿主和传染源。健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。成年猪常为隐性感染；受感染的怀孕母猪则出现流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等病征；受感染的新生仔猪出现发热及神经症状，甚至衰竭死亡，死亡率可达100％。

自1902年首次在美国发现伪狂犬病以来，该病己在全球范围内流行。我国自1947年首次发现伪狂犬病以来，至2006年已有31个省(区)、市有关于伪狂犬病的报道。伪狂犬病对我国乃至全球养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。检测猪伪狂犬病毒特异性IgM抗体为该疾病的早期诊断提供了新的方法，也为早期预防和净化猪场提供新的指标。

在PRV与宿主的相互作用中，病毒的gB和gD囊膜糖蛋白起着重要作用。病毒囊膜糖蛋白gB和gD不仅介导病毒对靶细胞的感染，也是被感染的宿主免疫系统识别的主要抗原。PRV gD为病毒感染必需的结构蛋白，该蛋白参与病毒的穿透过程，是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标。研究表明，gD基因是预防猪伪狂犬病重组腺病毒疫苗和核酸疫苗的重要靶序列，可以作为血清学诊断抗原。gE糖蛋白是PRV的一种十分重要的糖蛋白，在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但gE不是PRV增殖所必需的蛋白，常作为缺失的候选基因。猪伪狂犬病毒gE IgM抗体检测能有效地区分野毒早期感染。

目前，常用的监测PRV的方法包括乳胶凝集(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链反应(PCR)等。其中，ELISA具有敏感性高、特异性强等优点，被列为国际贸易指定检测项目之一。国外市场上针对PRV抗体检测的试剂盒很多，但这些试剂盒不能检测特异性抗原的抗体，即检测抗何种病原的抗体，如猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗原或其它病毒等。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒含有：包被猪IgM单克隆抗体的酶标板、封闭液、样品稀释液、检测用抗原、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物A溶液、酶底物B溶液和终止液，其中，所述的检测用抗原由纯化的猪伪狂犬病毒gE蛋白、结构蛋白gB和结构蛋白gD组成，所述的酶结合物为辣根过氧化物酶-抗gE、gB或gD蛋白抗体酶结合物。

本发明的优选技术方案中，所述的包被猪IgM单克隆抗体的酶标板所包被的猪IgM单克隆抗体的包被量为0.1μg-1μg/孔，包被稀释液为0.05mol/L的碳酸盐缓冲液，其pH9.6。

本发明的优选技术方案中，所述碳酸盐缓冲液的组成为，每升碳酸盐缓冲溶液中含有1.59g Na₂CO₃和2.93g NaHCO₃。

本发明的优选技术方案中，所述封闭液选自质量浓度为1-10％的BSA、质量浓度为1-10％的脱脂牛奶的任一种或其组合。

本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液由质量浓度为0.1-10％牛血清白蛋白(BSA)和含有0.01-0.05％NaN₃的磷酸盐缓冲液(PBS)组成，其中，所述磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.01mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选技术方案中，所述浓缩洗涤液为含有0.5v/v％的吐温-20的磷酸盐缓冲溶液，其中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.1mol/L，pH7.2-7.4。

本发明的优选技术方案中，所述的酶底物A溶液为1％的3，3’-5，5’-四甲基联苯胺(TMB)溶液；所述的酶底物B溶液为含有0.012％双氧水的乙酸钠缓冲溶液，其中，乙酸钠缓冲溶液的浓度为1％，pH5.0。

本发明的优选技术方案中，所述终止液为1mol/L H₂SO₄溶液。

本发明的优选技术方案中，所述样品稀释液的配制为：配置pH7.2-7.4、浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲液，再加入BSA和NaN₃，使其浓度分别为0.1-10％BSA和0.01-0.05％NaN₃，即得。