[发明专利]一种快速检测二斑叶螨对阿维菌素敏感性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种快速检测二斑叶螨对阿维菌素敏感性的方法。

背景技术

二斑叶螨是一种重要的世界性害螨，该螨对化学农药易产生抗药性，澳大利亚棉花上的二斑叶螨在毕芬宁登记注册4年后，就产生了抗药性。20世纪80年代二斑叶螨传入我国，由于它传入我国以前就对许多种农药已经产生了抗性，国内防治上主要依赖化学农药，这使得二斑叶螨的抗药性发展迅速，为害日趋严重。

阿维菌素作为抗生素类杀虫杀螨剂，作用机理是刺激虫体产生γ-氨基丁酸，阻断运动神经信息的传递，使害虫在几个小时内迅速麻痹、拒食、缓动或不动，其作用机制独特，见光易分解、无生物积累和残留、不易污染环境，成为人们防治二斑叶螨的首选药剂。但是，室内实验表明施用阿维菌素连续选育20代，二斑叶螨会对阿维菌素产生较高抗性。由于我国各地区的用药情况存在较大差异，因此二斑叶螨对阿维菌素的抗性亦不同，为了更好地指导农民合理用药，就需要检测出二斑叶螨对阿维菌素的敏感性。

目前，针对虫体较小、易结网的二斑叶螨的抗性监测多采用玻片浸渍法或者离心管法，玻片浸渍法需要处理24h后才能得出结果，难以达到快速检测的目的，而且玻片浸渍法为二斑叶螨提供一个开放的空间，有效空间农药浓度过低；离心管法由于管底浓度过高，管口浓度过低，导致死亡率测定不准确，因此，急需寻找一种能够快速准确检测二斑叶螨对阿维菌素敏感性的方法。

发明内容

针对上述问题，本发明提出了一种快速准确检测二斑叶螨对阿维菌素敏感性的方法，采用本方法，省时、省力、快速、简便。

本发明主要采用培养皿封膜法，其具体步骤为：

(1)挑取大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，并将其整齐固定于载玻片一端；

(2)将上述带螨载玻片置于人工气候箱中1h后，用双目镜观察，剔除死亡和不活泼个体，保留健康个体；

(3)将阿维菌素稀释至0.1-0.4mg/L，把带螨载玻片浸入药液中，轻轻摇动，5S后取出，迅速吸干螨体及周围多余的药液；

(4)将带螨载玻片放入培养皿中，用封口膜封住，形成密闭的药膜空间，置于人工气候箱中1h-4h后检查死亡率，并计算出死亡率。

由于螨类个体小，爬行速度块，容易逃脱，而且容易吐丝结网，多头虫体聚集在一起，造成后期镜检困难，难以准确判断虫体死亡与否，无法得到准确结果，因此本发明将雌成螨采用双面胶带固定。一般将双面胶带剪成2-3cm长，贴在载玻片的一端，用镊子揭去粘胶上的纸片，用零号毛笔挑取大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上但不要粘住螨足、螨须和口器，从而有效地避免了二斑叶螨结网抱团。载玻片长度约7-8cm，双面胶长度2-3cm，载玻片的剩余长度可以在浸药和镜检的时候便于操作。

在此过程中，如果雌成螨数量太少，会造成实验误差太大，使得实验结果的可靠性降低；过多，会使得操作麻烦，工作量加大，因此，为了保证实验结果的可靠性，每片载玻片上固定雌成螨30-50头，可以分成多行，这样在后期剔除掉不活跃的状态不好的虫子之后仍可以保证生测试验可靠性和准确性，又不会增加太多工作量，也便于观察。

实验过程中采用的培养皿直径规格为16cm，为保证实验结果的可靠性，同一培养皿中一般放置三个浸渍了同一浓度阿维菌素溶液的带螨载玻片。

将上述带螨载玻片置于人工气候箱中，为了适应二斑叶螨和二斑叶螨寄主植物生长的温度和湿度，人工气候箱的温度为25±1℃，相对湿度为75±5％。1h后，用双目镜观察，剔除死亡和不活泼个体，保留健康个体，优选保留20-40头，既保证了实验结果的可靠性，又不会增加工作量。

将上述的健康个体浸入稀释的阿维菌素溶液中，轻轻摇动5s后取出并迅速吸干螨体周围多余药液。为了保证较短时间内能检测出结果，本发明将阿维菌素溶液浓度稀释为0.1-0.4mg/L。

将浸液后的带螨载玻片放入培养皿中，用封口膜封住，形成一个密闭的药膜空间，从而保证了在有效的空间内维持农药的浓度适宜、均匀而且稳定，提高了实验结果的可靠性；为了使得农药药效有充足的时间得以显现，本发明将药效作用时间定为1-4h，经试验验证，优选3h。

另外，由于是本发明是短时间内测定，无法仅以完全死亡作为判定标准。本发明依次采用了不震动玻片、震动玻片、用毛笔轻碰试虫、震动玻片+用毛笔轻碰试虫四种镜检方法的比较试验，并对观察试虫几条腿动作为死亡与否的标准进行了比较，最终确定，镜检时先震动玻片，然后置于解剖镜下，活动的试虫即为活虫；对于不动的试虫再用毛笔轻碰，碰后活动活跃的仍为活虫，而只是反应式的动一下的即为死虫。