[发明专利]一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种植物总RNA提取方法，特别涉及一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法。

(二)背景技术

红掌(Anthurium andraeanum)是世界著名的盆栽、切花花卉，市场份额巨大，在我国有着广泛的种植区域。随着应用的扩大，红掌品种培育工作方兴未艾，但是由于资源的限制，新品种培育越来越困难，所以世界各地的育种专家都将新品种的培育寄托到生物技术上来。基于植物分子生物学发展壮大的生物技术育种，必须将研究深入到核酸水平，这期间，获得可靠、丰富的核酸信息是做好育种工作的前提，而RNA提取几乎是必不可少一个环节。

红掌的观赏器官是其苞片，而不是花，但是常规杂交育种必须研究其花器官，所以红掌苞片和花序的总RNA提取在其分子生物学育种过程中显得十分必要，但是目前国外对红掌分子生物学的研究刚刚展开，国内更是没有可借鉴的经验。在对模式植物及大宗农作物的研究中，Trizol作为一种广谱、高效的RNA提取试剂被广泛的应用，但是不同的植物对该种试剂的适用度不同，对于红掌而言，这种最为普遍的试剂却不能够提取出理想的总RNA。为了对红掌进行更为深入的研究，必须找到一种高效、快捷而又经济的总RNA提取方法，这样才能突破红掌的生物技术育种瓶颈。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种红掌的苞片和花序总RNA提取的方法，该方法高效、快捷、经济。

本发明采用的技术方案是：

一种红掌苞片和花序总RNA的提取方法，其特征在于所述方法为：(1)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨，获得研磨干粉；(2)将装有初始RNA提取液的离心管于63～67℃水浴预热，加入所述的研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15～20s，63～67℃水浴静置5～8min，加入初始RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15～20s，室温下静置5～8min，离心，获得上清液A；所述初始RNA提取液由终浓度如下的组分构成：0.2g/L十六烷基三甲基溴化铵、0.2g/L聚乙烯基吡咯烷酮、0.073g/L乙二胺四乙酸、1.168g/L氯化钠、0.121g/L Tris、体积浓度0.1％的焦炭酸二乙酯和体积浓度2％的β-巯基乙醇；(3)取上清液A，加入所述上清液A1/5体积的氯仿B剧烈摇晃15～20s后静置5～8min，离心，获得上清液B；(4)取上清液B，加入上清液B1/2体积的8M LiCl溶液，混匀，-20℃放置5～8h，离心，收集沉淀记为沉淀A，沉淀A用体积浓度75％乙醇水溶液洗涤，离心收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干到乙醇刚挥发完全为止，获得所述红掌苞片和花序总RNA。

本发明所述的红掌苞片和花序总RNA的提取方法，所述方法优选按如下步骤进行：(1)将幼嫩红掌苞片和花序置于研钵中液氮研磨，获得研磨干粉；(2)将装有初始RNA提取液的离心管于65℃水浴预热，加入研磨干粉，迅速盖严并剧烈摇晃15s，65℃水浴静置5min，加入初始RNA提取液1/5体积的氯仿A，再次剧烈摇晃15s，室温下静置5min，13000rpm/min离心15min，获得上清液A；所述初始RNA提取液由终浓度如下的组分构成：0.2g/L十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、0.2g/L聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、0.073g/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1.168g/L氯化钠、0.121g/L Tris、体积浓度0.1％的焦炭酸二乙酯(DEPC)和体积浓度2％的β-巯基乙醇；(3)取上清液A，加入上清液A1/5体积的氯仿B剧烈摇晃15s后静置5min，13000rpm/min离心10min，获得上清液B；(4)取上清液B，加入上清液B1/2体积的8M LiCl溶液，混匀，-20℃放置5h，12000rpm/min离心10min，收集沉淀记为沉淀A，并用体积浓度75％乙醇水溶液洗涤，离心收集沉淀记为沉淀B，沉淀B自然晾干至乙醇刚挥发完全为止，获得所述红掌苞片和花序总RNA。

进一步，所述8M LiCl溶液按如下方法制得：将LiCl溶于水，再加入焦炭酸二乙酯混合，室温下静置1～2天，然后1kg/cm²热压120℃蒸气灭菌20min，冷却获得8M LiCl溶液，所述水和焦炭酸二乙酯的体积比为1∶0.001，所述的LiCl的摩尔浓度为8M，这里所述的室温是指23℃±2℃。

步骤(4)所述沉淀B在室温下(23℃左右)自然晾干时间为10min。