[发明专利]二化螟与台湾稻螟的分子生物学区分方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及水稻害虫二化螟(Chilo suppressalis walker)和台湾稻螟(Chilo auricilia Dudgeo)的分子生物学区分方法，属于生物技术领域。

二、背景技术

二化螟和台湾稻螟是水稻上的常发性害虫，由于都属于钻蛀性害虫，较难防治，常常造成水稻的大面积减产。

二化螟和台湾稻螟的危害方式相似，幼虫都是先在叶鞘处危害，再从叶鞘处蛀孔侵入稻茎内。对水稻造成的危害状态也非常相似，都会形成枯鞘、枯心、枯孕穗等症状，根据稻田内的危害状况，我们无法准确判断是二化螟导致的危害还是台湾稻螟导致的危害。二化螟和台湾稻螟的幼虫通常都为6龄，幼虫体色相似且背部都有5条褐色纵线，利用肉眼观察很难将两者区分开来。再者，当二化螟或台湾稻螟被微生物感染后，虫体完全丧失原有的形态特征，导致无法判断是何种螟虫。

目前对于二化螟和台湾稻螟的鉴定，通常是借助于形态学特征来区分，这必须保证待测样本的关键形态学特征完好无损，但如上所述，当形态特征丧失后，则无法准确区分二化螟和台湾稻螟，这极大限制了二化螟和台湾稻螟相关领域的研究。例如，若要研究某地区二化螟或台湾稻螟的微生物侵染状况，但由于无法准确区分被微生物侵染的样本是何种螟虫，所以这一领域的研究受到了很大的限制。为了解决这一难题，我们发明了这一分子生物学区分方法。

三、发明内容

1、发明目的

提供一种准确区分二化螟和台湾稻螟的分子生物学方法，为非昆虫分类学教育背景的相关人员提供一种可靠的二化螟和台湾稻螟的区分方法。

2、技术方案

以待测样本的基因组DNA为模板，利用特异引物F：5’-GGGCAAGAAAGTAGACGCCTGGTT-3’和R：5’-AAAACCCAAAGAGGCGACACGGTA-3’进行PCR扩增。扩增产物用限制性核酸内切酶MspA1 I进行酶切消化，然后进行琼脂糖凝胶电泳。如果只有一条400bp的片段，则所检测的样本二化螟；如果得到两条片段分别为247bp和153bp，则所检测样本为台湾稻螟。

3、有益效果

本发明的方法与传统方法相比，主要优点有：(1)准确性高：传统方法会因为不同的鉴定人对各分类特征把握的不准确而导致鉴定结果出现误差。而本发明的方法是基于PCR的分子检测技术，而PCR技术已经发展的很成熟，拥有标准化和傻瓜化的实验流程，保证了结果的高准确性。(2)灵敏度高：传统方法对丧失形态学特征的样本无法进行区分。而基于本发明的方法，只要能从待测样本中提取微量的基因组DNA，就能够扩增得到目标PCR产物，从而完成对待测样本的鉴定。

四、具体实施方式

1、样本基因组DNA的提取

利用上海生工UNIQ-10柱式动物基因组DNA抽提试剂盒提取样本的基因组DNA，具体操作如下：

(1)待检测的样本，在液氮中磨成粉末，并转移置1.5ml的离心管中；

(2)加入300μl ACL Solution和20μl的蛋白酶K。(预先将蛋白酶K置37℃温育1小时，以利于激活蛋白酶K的活性)；

(3)涡旋震荡混匀1分钟，然后置于55℃水浴放置1-3小时，在此期间可以适当取出混匀，有助于充分裂解；

(4)取出样品，待降至室温后轻轻晃动混匀，然后12,000rpm离心5分钟；

(5)吸取300μl上清至UNIQ-10Column，然后再吸取300μl的AB Solution至UNIQ-10Column中，上下颠倒混匀2-3次，室温静置3分钟；

(6)3,000rpm离心3分钟，取下UNIQ-10Column，倒掉收集管中废液；

(7)将UNIQ-10Column放回收集管中，加入500μl Wash Solution，8,000rpm，室温离心30秒；

(8)重复步骤(7)一次；

(9)取下UNIQ-10Column，弃去收集管中的废液，将UNIQ-10Column放回收集管中，10,000rpm，室温离心30秒，以除去残留Wash Solution；

(10)将UNIQ-10Column放入干净1.5ml的离心管中，在UNIQ-10Column中央加入50μl Elution Buffer，室温放置2-3分钟。再10,000rpm，室温离心1分钟。离心管中的液体即为样本的基因组DNA，于-20℃保存备用。

2、PCR体系的配制