[发明专利]基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和水环境监测技术领域，涉及一种基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法。

背景技术

近10余年来的研究表明，水环境中存在大量病毒，这些病毒或感染进入水生生物细胞内、或漂浮在水体中，被称为浮游病毒。

浮游病毒是水体中含量最高的生物类群。浮游病毒含噬菌体(噬藻体)、藻类病毒，游离在水中的各种动植物病毒以及在极端水环境中的泉古菌病毒等类群。开发利用浮游病毒这类战略生物资源，筛选杀藻病毒(噬藻体)，是控制直至消灭有害藻华(赤潮)暴发的生物技术途径之一。

环境中病毒的定量检测方法主要包括传统培养法和显微镜技术(如透射电子显微镜法、荧光显微镜法)，现有的这些方法大多耗时费力，因此急需检测结果稳定，可快速定量检测的淡水环境中总病毒的方法。

流式细胞术(FCM)最先发展于二十世纪六十年代，并快速地应用于医学领域来进行哺乳动物细胞的分析。微生物学家七十年代后期才开始用这个工具。而如今随着荧光染料的不断改进，流式细胞术(FCM)正在迅速成为一种在环境水生微生物领域的不可或缺的工具。它使得微生物分析既可以在群落水平开展也可以在单细胞水平开展。与其他技术相比，FCM实现了快速的数据采集和多参数分析，因此得到了广泛的应用。目前，尚无可详细参考的有关使用流式细胞仪定量检测淡水环境中总病毒方法的报导。

发明内容

本发明的目的解决现有方法大多耗时费力的问题，建立一种利用流式细胞仪快速定量测定淡水环境中总病毒含量的检测方法。

本发明提供的基于流式细胞术快速定量检测淡水环境中总病毒的方法，步骤如下：

第1、水样过孔径为0.22μm的滤膜后加入戊二醛，使戊二醛的最终质量浓度为0.25％，并立即放入4℃冰箱；固定15min后用液氮冷冻并放置于-80℃的冷藏室中保存。

第2、检测前将第1步保存的水样置于室温下解冻；加入Na₂EDTA使最终浓度达到5mmol/l，随后加入荧光染料SYBR Green I储备液。

第3、将第2步处理后的水样于80℃避光染色10min，待冷却至室温后上流式细胞仪检测，水样测试前用Milli-Q水稀释至流式细胞仪检测浓度小于2×10⁵counts/ml。

其中第2步中的SYBR Green I储备液为：用过孔径0.22μm滤膜的二甲基亚砜(DMSO)稀释100倍SYBR Green I原液作为储备液，保存在-20℃下。染色前，将第1步保存的样品取出并在室温下解冻后，于每1ml中加入5μl SYBR Green I储备液。

第3步中的流式细胞仪，光源功率为50mW，发射波长488nm的蓝色激光，使用流式细胞仪进行测定时，通过调节滤光片来收集发射光信号，信号收集软件为FlowMax。绿色荧光(FL1)被设定为触发参数，信号收集波长520±20nm，SSC为侧向散射光；所有信号均被收集在绿色荧光与侧向散射光的二维散点图上。

本发明的优点和积极效果：

本发明方法避免了现有淡水总病毒测定中耗时费力的问题，在水样采集保存后，利用本发明中的方法，仅在30min之内即可完成水样的染色，上机并给出检测结果，实现了淡水总病毒的快速定量测定。利用该方法不但可以得到水中总的病毒含量，还可以根据绿色荧光与侧向散射光的二维散点图来分析病毒的群落结构特征。本该方法操作步骤简单，检测用时短，在淡水病毒检测及水生生态学研究等领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为利用本发明方法在流式细胞仪上得到的淡水样品中总病毒检测结果，其中R1所包含的区域为某淡水样品中的病毒，最终检测浓度为3.4×10⁸counts/ml；

图2为利用本发明方法在流式细胞仪上得到的Milli-Q水样中总病毒检测结果。

图3为利用本发明方法检测河水稀释水样所得浓度与稀释程度的关系。

具体实施方式

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1天津某淡水水样中病毒总量的检测

第1、将采集到的淡水水样过0.22μm滤膜，加入适量戊二醛进行固定，使戊二醛的最终质量浓度为0.25％，并立即放入4℃冰箱；待15min后用液氮冷冻并放置于-80℃的冰箱中保存。