[发明专利]一种副溶血性弧菌检测试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于它包括：

(1)免疫富集反应体系组分：

偶联了副溶血性弧菌多克隆抗体的直径1.0-2.8μm免疫磁珠；含0.02％w/v叠氮化钠、以及含0.1％w/v牛血清白蛋白的pH为7.4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠保护液；含有1％w/v牛血清白蛋白的pH为7.4的磷酸盐缓冲液组成的免疫磁珠工作液；0.05mol/L、pH为6.4的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液作为免疫富集反应液；含0--0.1％Tween-20的pH为7.4的磷酸盐缓冲液作为免疫富集洗脱液；

(2)环介导等温核酸扩增体系组分：

反应缓冲液由20mM KCl；20mM(NH₄)₂SO₄、40mM Tris、8mM MgSO₄、0.2％Tween-20组成的反应缓冲液；含10mM dNTP；20μM FIP/BIP、20μMLF/LB；8000U/ml Bst DNA聚合酶；200μM羟基萘酚蓝；

(3)一套基于副溶血性弧菌tlh基因的环介导等温扩增技术的特异性引物：两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。

2.如权利要求1所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其特征在于：所述的两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB，其序列分别如下：

F3   5’-GATACTCACGCCTTGTTCGA-3’

B3   5’-TGCAACATAGCGGTGAGTTG-3’

FIP  5’-CGACAGACGATGAGCGGTTGAT-CCGAAGAGCACGGTTTCG-3’

BIP  5’-CCACGCATTGCGCTCTGAGT-TGTTGTTGGATGCGTGACAT-3’

LF   5’-AGGATCGCTCGCGTTCA-3’

LB  5’-CAGCGTCTGGTGCTGAGAAG-3’。

3.如权利要求1所述的一种副溶血性弧菌的检测试剂盒，其检测方法为：

(1)取免疫磁珠溶液不少于0.75mg，经磁力架富集分离去除免疫磁珠保护液，等体积加入免疫磁珠工作液，备用；

(2)在反应管中加入免疫富集反应液和待检测样品共50ml，再加入备用的免疫磁珠，洗脱管中加入免疫富集洗脱液35ml，采用仪器进行免疫富集，反应结束后，加入100μl PBS重悬免疫磁珠，备用；

(3)取免疫磁珠和菌体细胞的复合物100μl，5000rpm/min，离心1min，去除上清液，加入50μl去离子水，95℃，煮沸5min，热裂解法提取DNA后置于4℃冰箱备用。

(4)按反应缓冲液，12.5μl；10mM dNTP，1μl；20μM F3/B3，0.5μl；20μM FIP/BIP，2μl；20μM LF/LB，1μl；8000U/mL Bst DNA聚合酶，1μl；200μMHNB，2μl；DNA模板，2μl配置反应体系，实现环介导等温核酸扩增；反应体系反应温度为64℃，时间为30min，85℃灭活5min；最后用肉眼观察反应后颜色变化，并根据潘冬色卡判定结果。