[发明专利]γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法

说明书

技术领域

本发明属于聚谷氨酸的生产方法，具体涉及一种γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产的新方法。

背景技术

γ-聚谷氨酸(Poly-γ-glutamatic acid，γ-PGA)，是一种由多种微生物产生的水溶性和可生物降解的聚氨基酸。聚谷氨酸是一种对人体和环境无毒害的新型天然高分子，其独特的结构特性赋予高度吸水性、良好的渗透性、生物相容性和生物可降解性，广泛应用于农业、医药、食品、化妆品等许多领域，是一种公认的极有发展潜力的绿色化学产品。γ-聚谷氨酸的生产主要利用芽孢杆菌属的一些菌株，直接发酵生产。相对以石油衍生品为基础的聚合物，γ-聚谷氨酸合物能够通过可再生原料合成，具有相当大的市场潜力。

γ-PGA生产方法分为两类：一类是在发酵培养基中添加L-谷氨酸作为γ-PGA合成的前体，由微生物吸收培养基中的谷氨酸，并利用其合成酶系将单体谷氨酸聚合产生γ-PGA，即谷氨酸依赖性合成方法，例如专利CN1644677A所述的γ-PGA生产方法；另外一类是在发酵培养基中不添加L-谷氨酸，有微生物直接将培养基中的糖质原料转化为内源性谷氨酸，再由自身的合成酶系聚合产生γ-PGA，这称为从头合成，即谷氨酸非依赖性合成方法，也称为从头合成，例如专利CN 1932007A所述的γ-PGA生产方法。

两种生产方法中，γ-聚谷氨酸生产水平很大程度上受到培养基成分和培养条件的影响。许多研究已经确定了生产γ-PGA的最佳培养基成分。通常使用的培养基包括碳源，氮源和无机盐类，L-谷氨酸依赖性合成方法需要加入大量外源谷氨酸作为聚谷氨酸的前体。一般来说合适的碳源通常是葡萄糖，甘油，麦芽糖，柠檬酸，果糖，蔗糖，淀粉等，合适的氮源通常是氯化铵，硫酸铵，蛋白胨，酵母膏等。

已有大量文献报道了谷氨酸依赖性合成方法生产聚谷氨酸的方法，包括培养基组分的优化，间歇发酵和流加发酵方法，γ-PGA的提取分离方法等。流加发酵的方式包括：流加糖类为细胞生长和聚合物合成提供能量(参见专利：CN1556859A)；流加L-谷氨酸前体增加聚谷氨酸产量。目前的发酵生产聚谷氨酸的方法中，培养基中需要添加谷氨酸作为前体导致了高的原料成本，成为工业化生产和应用的主要瓶颈之一。而不添加谷氨酸的发酵过程，只能产生低浓度的聚谷氨酸，过低的生产效率不适合工业化规模的生产。因此，通过开发新的发酵生产方法，以较为廉价的底物替代L-谷氨酸，生产高浓度的γ-聚谷氨酸，成为市场的新需求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种γ-聚谷氨酸的谷氨酸非依赖性生产方法，能够以较为廉价的成本，生产高浓度的γ-聚谷氨酸。

本发明方法所采用的技术方案包括如下步骤：

将芽孢杆菌属微生物接种到含有发酵培养基的发酵容器中，在有氧条件下培养，发酵过程中持续搅拌，向发酵培养基中加入草酸，使其产生γ-聚谷氨酸。草酸采用流加方式加入到发酵培养基中，在补料分批发酵条件下培养芽孢杆菌属微生物，使其产生γ-聚谷氨酸；当草酸浓度低于1g/L时，开始流加草酸溶液，使其维持到1-12g/L。其中芽孢杆菌属微生物选自具有γ-聚谷氨酸合成能力的枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌中的任意一种，优选枯草芽孢杆菌C10(Bacillus subtilis C10)(保藏号CGMCC No.4924)或枯草芽孢杆菌ZJU7(Bacillus subtilis zju-7)(保藏号CGMCC No.1250)菌株。本方法中使用的发酵培养基不包含谷氨酸。草酸可由草酸盐代替。在补料分批发酵过程中机酸是以间歇流加的方式加入发酵培养基。向发酵培养基中流加草酸的同时也可以流加氮源，使氮源浓度维持在1～10g/L，其中氮源选自氯化铵，硫酸铵、蛋白胨或酵母膏中的任意一种。

本发明的方法中，草酸添加到培养基中，其作用是作为γ-PGA合成的刺激剂，刺激菌体细胞产生高浓度的γ-PGA，γ-PGA的前体谷氨酸来自于菌体自身合成，发酵过程中，草酸被菌体吸收并分解为二氧化碳。因此，该方法同时也为草酸或草酸盐提供了一种新的用途。

发酵培养基中除草酸之外的其他成分包括现有用于生产γ-聚谷氨酸的氮源、碳源和无机盐。如使用葡萄糖、蔗糖、果糖、甘油、淀粉作为碳源；使用氯化铵、硫酸铵、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、玉米粉等作为氮源；也包括菌体生长所需的各种无机盐如铁盐，镁盐，钾盐，钙盐，磷酸盐。