[发明专利]一株可以调节人肠道菌群的益生菌及其检测方法

权利要求书

1.一株可以调节人肠道菌群的益生菌，其特征在于所述益生菌(Lactobacillus plantarum P8)分离自内蒙古牧民手工制作的酸奶中，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号：CGMCC No.5468，保藏日期为：2011年11月18日。

2.可以调节人肠道菌群的益生菌的检测方法，其特征是包括下列步骤：

(1)粪便样品中宏基因组DNA的提取：

采用液氮冻融-CTAB法：取1.0g粪便样品洗涤处理，将洗脱的菌体于1.5mL离心管中，立即置于液氮中完全冻结，取出后放入65℃水浴中融化，反复冻融3次，加0.1mL 10％SDS和10.0μL 10mg/mL蛋白酶K，于37℃恒温摇床中200r/min摇动2h，室温下12000g离心10min，收集上清液转移至另一离心管中；上清液与等体积的氯仿于12000g离心10min，吸取上清液转移至另一离心管中进行酚氯仿抽提2次，经0.1倍体积的醋酸钠，1倍体积的冰异丙醇沉淀总DNA，然后70％乙醇洗涤沉淀2次，回溶备用；

(2)肠道优势菌群特异性引物设计

针对双歧杆菌属，拟杆菌门，所装菌属和奇异菌属设计合成四组特异性引物，菌体引物信息见下表：

扩增体系：

反应体系50μL：10×PCR Buffer 5μL，25mmo1/L Mg²⁺1.0μL，2.5mmol/LdNTPs 4μL，5mmol/L上下游引物各2μL，DNA模板100ng左右，5U/μL Taq酶(Promega)0.5uL，dd H₂O补足至50μL；

扩增条件：

95℃变性5min；循环30次：95℃变性1min，退火45s，72℃延伸1min，然后72℃延伸7min，4℃保存；

(3)琼脂糖凝胶电泳

将PCR产物于1％琼脂糖凝胶中以5V/cm的电压，电泳20-30min，EB染色，紫外拍照，检测扩增效果；

(4)外标准品的制备

应用特异性引物扩增双歧杆菌属，拟杆菌属，普拉梭菌属和奇异菌属的特异性片段，检测后胶回收各自片段达到纯化的目的；而后将纯化的片段和pMD-19T载体连接，连接后转化到大肠杆菌感受态细胞中，挑选阳性克隆子酶切验证，将验证过的阳性克隆子提取质粒，测定浓度后计算拷贝数作为外标准品以供后续试验未知样品中该菌属的定量使用；

(5)RT-PCR检测样品中各个优势菌属的数量

首先应用上述外标准品制作各个菌属的标准扩增曲线，然后以标准曲线为依据，用各个菌属的特异性引物定量检测样品中双歧杆菌属，拟杆菌属，普拉梭菌属和奇异菌属的数量；

RT-PCR扩增体系：

反应体系20μL：10×PCR mix 10μL，10mmol/L上下游引物各0.4μL，DNA模板100ng左右，dd H₂O补足至20μL；

RT-PCR扩增条件：

95℃变性20s；循环40次：95℃变性5s，退火30s，72℃延伸35s。