[发明专利]稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP及其方法与应用

权利要求书

1.一种稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于：是由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻总DNA中扩增出的核苷酸序列，并经特异性酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pik-m呈特异性带型的分子标记；

所述的引物对的核苷酸序列如下所示：

SEQ ID NO.1：5’-TCGCCGGTGACCTAAGAGAT-3’；

SEQ ID NO.2：5’-GATTTCACCGGCGCAAGCAT-3’。

2.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于：所述的水稻为水稻品种Tsuyuake。

3.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pik-m包括2个编码NBS-LRR类蛋白的基因Pikm1-TS和Pikm2-TS。

4.根据权利要求1所述的稻瘟病抗性基因Pik-m的功能特异性分子标记PikmFNP，其特征在于：所述的特异性酶切为Mbo I酶切。

5.权利要求1～4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于：通过对多个水稻稻瘟病抗性基因Pik-m的等位基因序列与Pikm1-TS及Pikm2-TS做比对的方法，分析得到能区别于其抗、感病等位基因以及其他稻瘟病抗性基因的Pik-m功能特异性的1处单碱基差异，再通过引物设计得到SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2，对水稻DNA进行扩增得到Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP。

6.根据权利要求5所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)通过常规PCR法扩增，获得多个K型水稻品种的Pik-m等位基因的编码区DNA序列；

(2)利用多序列比对软件工具，将步骤(1)所获得的序列翻译成蛋白质序列后进行比对，得到Pik-m抗性基因所特异的1个单碱基差异，其位于Pik-m组成基因中的Pikm1-TS的CC区域，最终导致功能特异性氨基酸的改变；

(3)根据步骤(2)所得到的1个单碱基差异以及dCAPS标记的原理，利用Primer Premier 5.0软件工具设计出引物对SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2；并用这组引物分别对不同水稻的总DNA进行PCR扩增反应，然后分别对扩增产物进行酶切、电泳，比较验证；

(4)对步骤(3)所获得的分子标记在不同水稻品种中进行验证，从而确定Pik-m抗性基因的功能特异性的分子标记PikmFNP。

7.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于：步骤(1)所述的K型水稻品种包括Shin 2、Tsuyuake、Kusabue、K3、K60、黑交4以及Q1063。

8.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述的PCR的反应体系如下：10×PCR Buffer 2μl、2.5mM dNTP 1.6μl、10μM引物SEQ ID NO.10.5μl、10μM引物SEQ ID NO.20.5μl、5U/μl rTaq酶0.1μl、50ng/μl DNA模板1μl、双蒸水补至20μl；

所述的PCR的反应条件如下：预变性94℃3分钟；94℃30秒、58℃30秒、72℃1分钟，扩增35个循环；72℃5分钟；10℃保存。

9.根据权利要求6所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的检测方法，其特征在于：

步骤(3)中所述的酶切为利用限制性内切酶Mbo I对所获得的PCR产物进行酶切，其反应体系如下：10×酶切缓冲液1.2μl、PCR扩增产物5μl、Mbo I酶0.25μl，双蒸水补至12μl。

10.权利要求1～4任一项所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP的应用，其特征在于：所述的稻瘟病抗性基因Pik-m功能特异性分子标记PikmFNP应用于在大量的水稻种质资源中筛选、鉴定该功能性抗性基因，以及在分子标记辅助选择育种、基因聚合育种以及转基因育种。