[发明专利]一种用于染色体整合、进化的表达质粒

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种用于染色体整合、进化的表达质粒，以及其构建方法。

背景技术

利用基因工程微生物生产有用物质已成为物质制造的新的模式。目前，通常采用含目的基因的质粒表达系统来构建工程微生物。但是这种质粒表达系统往往有存在质粒易丢失、不稳定、且质粒的存在又将增加宿主菌的代谢负担。更为严重的是质粒往往又含有抗生素抗性筛选标记，这将严重影响环境污染问题，导致环境中抗生素耐药菌泛滥，从而限制了含质粒的工程菌的工业化进程。

为了解决质粒表达系统的上述缺陷，将目的基因整合到微生物染色体上是一个非常有效的方法。为此，许多科学家研发了许多质粒来整合基因到染色体上。美国普渡大学Haldimann and Wanner(2001)开发了一系列条件复制整合调节(CRIM)质粒，利用该质粒可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上(Haldimann，A.，Wanner，B.L.Journal of Bacteriology.2001，183：6384-6393)。但是，利用这些质粒整合基因到大肠杆菌的染色体上后，质粒上的抗生素抗性筛选标记和复制子仍然保留在染色体上。所构建的工程菌仍然存在抗生素抗性筛选标记导致环境中耐药菌泛滥的问题。为克服他们的质粒缺陷，台湾Chiang et al.在他们工作的基础上有开发了一系列用于基因整合的质粒，应用这些质粒同样可将事先连接到质粒上的目的基因，通过简单的质粒转化，单拷贝地整合到大肠杆菌染色体上特定的噬菌体整合位点上，而且所得到的工程菌不含抗生素抗性筛选标记和复制子，可用于工业化生产(Chiang，C.-J.，Chen，P.T.，Chao，Y.P.Biotechnology Bioengineering 2008，101：985-995)。但是，上述2个团队的质粒都只能将目的基因单拷贝地整合到大肠杆菌的染色体上，而实际工作中往往需要整合多拷贝的基因以提高基因的表达水平，从而提高微生物的生产能力。为此，美国麻省理工学院Tyod et al.开发了一种可提高整合基因拷贝数的质粒pTGD，利用λInCh基因组整合技术，将质粒上的目的基因整合到大肠杆菌染色体上后，因质粒上携带了抗生素抗性基因(与目的基因串列在一起)，可利用所谓的化学诱导染色体进化技术，提高目的基因在染色体上的拷贝数(Tyo，K.E.J.，Ajikumar，P.K.，Stephanopoulos，G.Nature Biotechnology 2009，27：760-765)。他们所得到的工程菌虽然基因的拷贝数因化学诱导染色体进化得到了增加，但是他们使用的基因整合技术是λInCh基因组整合技术，需要4个步骤，比较复杂，不利于工业应用，而且工程菌仍然含有抗生素抗性筛选标记，不适合于工业化生产。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的是提供一种用于染色体整合、进化的表达质粒。该表达质粒可以通过直接质粒转化将目的基因插入工程菌的染色体中，并可以通过化学诱导提高目的基因在染色体上的拷贝数。

本发明所采用的技术方案是：

一种用于染色体整合、进化的表达质粒，含有2个FRT位点(可被FLP重组酶识别)、抗性筛选基因a、复制子、噬菌体整合位点(attP)、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、及启动子与抗性筛选基因β两侧连接的2个异源的核苷酸序列相同片段A1和A2，抗性筛选基因a与抗性筛选基因β为不同的抗性基因。

优选的，所述质粒的结构为：在两个FRT位点的一侧按顺时针方向依次含有片段A1、启动子(P)及其后面的多克隆位点(MCS)、终止子(TTR)、用于诱导染色体进化过程的抗性筛选基因β、片段A2、噬菌体整合位点(attP)，在两个FRT位点的另一侧则含有抗性筛选基因a和复制子(如图1所示)。

优选的，所述抗性筛选基因a为卡那霉素抗性基因(kan)。

优选的，所述复制子为大肠杆菌的条件复制子(ori Rγ)。

优选的，所述噬菌体整合位点(attP)为attP_HK、attP_P21、attP_λ、attP_φ80和attP_P22中的任一种。