[发明专利]禽流感病毒灭活疫苗的制备方法及产品

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗的制备方法及其产品，尤其是涉及一种禽流感灭活疫苗的制备方法以及由此方法获得的产品。

背景技术

当前禽流感灭活疫苗的生产主要是采用鸡胚繁殖法，该培养方式是通过将禽流感病毒接种到鸡胚尿囊液中，随着鸡胚的生长，病毒大量复制繁殖，通过收获接毒鸡胚尿囊液获得大量病毒的方法。该工艺虽简单易行，但资源浪费严重，劳动强度大、生产周期长、生产效率低，尾产物无害化处理难度大，存在生物安全风险。

悬浮培养技术在国际生物制药领域早已得到广泛应用，在过去几十年来，全球大规模培养技术发展迅速，从使用转瓶、CellCube等贴壁细胞培养，发展为生物反应器大规模细胞培养。反应器在工业中的应用规模不断扩大，目前全球生物制药生产中生物反应器使用率已经达到70％以上，在兽用生物制品的生产中也得到广泛的应用，如Wellcome集团分布于欧洲、非洲和南美洲8个国家的生产厂商，应用此技术工业化生产口蹄疫疫苗和兽用狂犬疫苗。

我国生物制药技术产业中大规模工业化培养动物细胞起步较晚，远远落后于国际先进水平，国内多数生物医药生产企业细胞培养规模及对生物反应器的应用仍停留在起步时期、实验室规模，发展较为缓慢。国内人用和兽用疫苗生产企业100余家，目前只有3～5家人用疫苗的生产企业应用反应器进行动物细胞培养技术生产疫苗，不足10％。

此外，目前尚没有采用细胞以及生物反应器等方式大规模生产禽流感灭活疫苗的技术。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种利用细胞及生物反应器等方式生产禽流感灭活疫苗的方法。该方法可以进行大规模生产，且制品的安全性良好，由接种疫苗导致的副反应较少。

本发明的另一个目的在于提供一种禽流感灭活疫苗，该疫苗利用细胞及生物反应器来进行生产，制品安全性高，由接种疫苗导致的副反应少。

为了解决上述技术问题，本申请的发明人进行了反复研究，发现如下技术方案可以解决上述技术问题。

本发明提供一种禽流感灭活疫苗的制备方法，包括如下步骤：

1)制苗用细胞的传代与培养：将细胞经EDTA-胰酶细胞分散液消化传代，用细胞生长液在细胞培养瓶或生物反应器中培养，形成培养细胞；

2)病毒适应细胞驯化：用细胞维持液将禽流感病毒稀释至浓度为0.1～5wt％的病毒液，将该病毒液接种到长成单层细胞的培养板，添加TPCK胰酶，在温箱吸附0.5～3h后补充细胞维持液，置于培养箱中培养；基于相同上述方法，连续传代使病毒适应细胞从而获得驯化好的禽流感生产毒种；

3)任选地，建立病毒种子批：取低代毒种建立原始种子、基础种子、和/或生产种子；

4)制苗用病毒的培养：将步骤1)的培养细胞接种步骤2)驯化好的禽流感生产毒种，添加TPCK胰酶，吸附0.5～3h后，添加细胞维持液继续培养；

5)制苗用病毒液的收获：病毒培养至10～50h后，取样检测培养基中的葡萄糖残留含量及病毒液血凝价，当两项检测值均趋于稳定时，收获病毒液；

6)任选地，制成疫苗成品：将收获的病毒液离心分离、灭活、乳化制成疫苗成品。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中的培养细胞在40代以内。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中的细胞生长液为含8～10wt％血清的DMEM培养基、含3～5wt％血清的DMEM低血清培养基、或者无血清培养基。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤1)中培养条件为：溶氧30～60％、pH为7.0～7.3、温度为36.5～37.5℃、和/或反应器转速为40-50rpm。优选地，步骤1)中进行反应器自动控制、和/或细胞悬浮培养。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中的TPCK胰酶的添加量为0.1～3.0μg/ml，即添加TPCK胰酶直至体系中TPCK胰酶浓度为0.1～3.0μg/ml。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤2)中的培养条件为pH为7.0～7.2、温度为36～37℃、和/或CO₂浓度为5％。优选地，步骤2)中进行病毒适应细胞培养。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤3)中的原始种子为2～5代、基础种子为6～9代、和/或生产种子不超过13代。

在本发明的制备方法中，优选地，步骤4)中培养条件为溶氧40～60％、pH为7.0～7.2、温度为36～37℃、和/或反应器转速为50rpm。