[发明专利]一种基于MYPT1基因敲除建立新型高血压小鼠模型的方法及其用途

说明书

技术领域：

本发明涉及到病理学、生理学，遗传学，分子生物学领域。本发明通过基因敲除技术，降低小鼠内源性MYPT1的表达，从而达到使小鼠血压升高的目的。 

背景技术：

本发明旨在提供一种建立自发的、可遗传的高血压小鼠模型的方法。高血压是一种严重影响人类健康的疾病，其危害性在于它会导致很多并发症，比如心衰，肾衰，脑中风等，从而导致死亡。目前关于绝大多数高血压病的发病机制并不清楚，这一类疾病被称为原发性高血压。因此，利用动物模型研究高血压疾病可以为人类高血压疾病的诊断、治疗提供理论基础。 

目前用来研究高血压动物模型主要有以下几种：1、慢性实验性高血压类型；2、神经源性高血压；3、肾源性高血压；4、内分泌性高血压。这些建立高血压模型的方法大多要经过外源性药物或其它方法处理，甚至是通过手术手段，不能完全模拟人类的原发性高血压，而遗传性的高血压模型可以最大程度的模拟临床上原发性的高血压，也高有利于研究高血压的发病机制，治疗药物靶点的设计。另外，遗传性高血压模型个体之间不存在手术操作或者药物剂量导致的差异，其背景高度一致，可以作为新药筛选的有用工具。 

关于高血压的发生机制目前并不是很清楚。经典理论认为，肾脏功能紊乱是引起高血压关键因素，但是，近几年的研究表明，血管平滑肌病变也可以直接导致高血压的产生。因此，研究血管平滑肌收缩机制及其在高血压发生中的作用，可以为高血压的诊断和治疗提供有效指导。 

发明内容：

本发明的目的是建立一种高血压小鼠模型，该动物模型血压自发性的升高，稳定性强，并且其高血压性状是可遗传的，与人类原发性高血压类似。 

本发明还提供了一种建立高血压小鼠模型的方法，即通过在平滑肌组织特异性敲除MYPT1，提高MYPT1底物肌球蛋白调节轻链的磷酸化水平，从而导致血管平滑肌收缩增强，外周血管阻力增大，形成高血压。 

本发明是通过以下技术方法实现的：(1)建立MYPT1敲除模型；(2)测量小鼠尾动脉压；(3)通过小动物成像系统检测小鼠的心功能；(4)用ELISA试剂盒检测小鼠血清中肾素、血管紧张素、醛固酮的浓度；(5)用肌张力仪测量小鼠阻力血管的收缩张力；(6)用尿素甘 油胶电泳分析小鼠阻力血管中肌球蛋白调节轻链磷酸化；(7)尾静脉注射高血压药物后检测小鼠的尾动脉压。 

附图说明

图1为建立MYPT1平滑肌特异性敲除小鼠的策略。 

图2为MYPT1敲除和对照组小鼠的血压值。(A)成年敲除和对照小鼠的收缩压、舒张压以及平均血压。(B)敲除和对照小鼠的收缩压随年龄增长的变化曲线。 

图3为ELISA检测的MYPT1敲除和对照组小鼠的血清中肾素(A)、血管紧张素(B)、醛固酮(C)的浓度， 

图4为MYPT1敲除和对照组小鼠的心功能参数。 

图5为MYPT1敲除和对照组小鼠的心率。 

图6为MYPT1敲除后血管在各种刺激下的收缩张力变化，其中包括124mM氯化钾溶液、10uM去甲肾上腺素(NE)、0.1uM内皮素(ET1)、10uM血管紧张素(AngII)、1uM加压素(Vasopressin)、0.1uM血栓素类似物(U46619)。 

图7为MYPT1敲除后血管中的肌球蛋白磷酸化水平变化。(A、C)分别为氯化钾、去甲肾上腺素刺激后，肠系膜动脉血管中的RLC的磷酸化检测的结果，(B、D)为统计结果。 

图8为利用MYPT1敲除小鼠检测降压药药效检测实例。(A)为培哚普利片以1.2ug/g小鼠体重尾静脉注射，连续五天注射期间小鼠的收缩压变化。(B)为苯磺酸氨氯地平片以1.5ug/g小鼠体重尾静脉注射，连续五天注射期间小鼠的收缩压变化。 

具体实施方式

本发明的实施步骤说明如下： 

1.平滑肌特异性敲除MYPT1的小鼠模型的构建