[发明专利]用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，属于生物中核酸应用技术领域。

背景技术

核酸研究是现代生物学、医学研究中的重要课题。核酸作为遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，除了在生物体的生长发育繁殖等生命活动中有十分重要的作用外，它与生命的异常情况，如肿瘤发生、放射损伤、遗传疾病等也有密切关系。在医学上对于临床诊断和治疗监测越来越重视，同时相应的对病毒核酸的提取及定量检测的方法也越来越受关注。目前用于病毒核酸定量检测的方法基本上是利用荧光定量检测技术来测定，这种实时定量检测方法不但方便简单且不易引起污染，所以应用越来越广泛。而对于病毒核酸的提取方法主要有以下几种：一步法、煮沸法、过柱法和磁珠法。据调查研究表明：磁珠法自动化程度高，提取速度快，提取效率高，可重复性好，抗干扰能力及对扩增试剂的兼容能力强。因而磁珠法被广泛应用于常规科研、基因组学、疾控系统、食品安全、法医等领域。

目前病毒核酸的磁珠法提取及检测流程为：样品裂解—磁珠与待分离病毒核酸(以下简称DNA)特异性结合—磁珠-DNA混合物的洗涤—磁珠与待分离DNA的洗脱分离—取洗脱液进行定量检测(即裂解-结合-洗涤-洗脱-检测五步)。该方法整个过程分为五步，其中第四步需要孵育洗脱分离，对于想快速提取并检测的使用者较为繁琐。

发明内容

本发明的目的是提出一种用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，采用特殊的病毒裂解液提取病毒核酸，以使提取工艺简单、高效、快速，方便地进行病毒核酸的提取和检测。

本发明提出的用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，包括以下步骤：

(1)将10～50微升待测样本加入到联排管中，联排管中含有：体积为待测样本体积3倍的病毒裂解液以及10微升磁珠，混匀，使核酸释放，磁珠与核酸结合，得到核酸和磁珠的混合物，其中所述的病毒裂解液的成分为：摩尔浓度为5～6摩尔/升的异硫氰酸胍、摩尔浓度为50～100毫摩尔/升的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、摩尔浓度为1～10毫摩尔/升的乙二胺四乙酸二钠、摩尔浓度为50～65毫摩尔/升的二硫苏糖醇、25～30微克/毫升的糖原、体积比为1％的聚乙二醇辛基苯基醚、体积比为2％的非离子表明活性剂-NP40、体积比为0.5％的吐温80；

(2)将上述含有核酸和磁珠的混合物的联排管置于磁力架上，通过磁力作用将吸附有核酸的磁性颗粒与溶液分开，弃掉溶液，取下联排管；

(3)向上述步骤(2)的联排管中加入100微升去蛋白缓冲液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(4)向上述步骤(3)的联排管中加入100微升去盐漂洗液，充分混匀，在磁场作用下使磁性颗粒与液体分开，弃掉溶液，取下联排管；

(5)将上述步骤(4)的联排管置于室温，晾干2分钟，充分挥发管中残余液体。

本发明提出的用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，其优点是：

1、本发明提出的病毒核酸的提取方法中，在裂解时使用了特殊的病毒裂解液，这种裂解液不仅增加了细胞裂解效果，裂解彻底而且快速，更重要的是它能够屏蔽磁珠对荧光定量检测的抑制作用，从而可以直接进行检测。

2、本发明提出的病毒核酸的提取方法中，省去了磁珠与待分离DNA的洗脱分离，操作更为方便快捷，省去了长时间孵育的过程。

3、使用本发明的病毒核酸的提取方法，提取得到磁珠核酸混合物用于荧光定量检测，可以极大的提高荧光检测灵敏度，即使微量的核酸病毒样本也可以进行检测，节省了检测成本，提高了检测效率。

4、本发明提出的病毒核酸的提取方法中，每个样品的提取和检测过程在一管中完成，不仅不易引起污染，而且简化了操作步骤，这不但节约了生产成本而且还提高了操作的准确性。

5、使用本发明的病毒核酸提取方法，提取核酸的效率高，得到的核酸纯度高，检测重复性好，对荧光检测中的扩增试剂的兼容性好，极大的方便了临床诊断以及法医鉴定等方面的工作。

附图说明

图1是利用本发明方法提取的病毒核酸与已有的洗脱法(DP327)提取的病毒核酸进行荧光定量检测的扩增曲线比较图。

图2是本发明方法的实施例中样本浓度梯度稀释后提取并荧光定量检测的扩增曲线图。

具体实施方式

本发明提出的用于荧光定量检测的一管式磁珠法病毒核酸的提取方法，包括以下步骤：