[发明专利]一种高表达鼠HDAC6的抗病毒感染转基因鼠

说明书

技术领域

本发明涉及制备高表达鼠组蛋白去乙酰化酶6的转基因鼠的方法，属于生物与新医药领域。

背景技术

组蛋白去乙酰化酶6(Histone deacetylase 6，HDAC6)对提高人类或动物的抗病毒感染能力和研究肿瘤细胞的迁移机制、药物作用靶点具有重要作用。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)是一组在细胞染色质水平、通过诱导组蛋白去乙酰化来调通包括染色质重组、转录活化和抑制、细胞周期、细胞分化及细胞凋亡等一系列生物学效应的酶，特别是与基因活化后的及基因转录表达调通有关。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)则是一类抑制HDACs作用的化合物。HDACs通常仅有一个催化结构域，目前研究表明其作用是对核内与染色体结合的组蛋白进行去乙酰化作用，从而调控基因的表达。HDAC6是组蛋白去乙酰化酶家族的一个重要成员。与其它HDACs不同HDAC6是一种特殊的组蛋白去乙酰化酶，每个蛋白分子具有2个催化结构域，除了调控组蛋白的乙酰化水平外，其对胞质种微管蛋白的乙酰化水平同样具有调节作用。而微管蛋白与肿瘤细胞的迁移、病毒入侵时对细胞的调节具有重要作用。HDAC6主要分布在细胞质中，通过影响细胞骨架相关蛋白以及Hsp90等蛋白的乙酰化水平，在多种细胞活动中发挥调节作用。HDAC6可以通过多种机制，发挥其广谱抗病毒活性，对多种病毒具有抗性并增强机体的免疫力：一方面，HDAC6可以通过对细胞膜内侧的细胞骨架的调节，影响细胞膜的动态性，抑制病毒包膜与细胞膜的融合，阻止病毒的入侵，另一方面，HDAC6还可以通过抑制病毒复制相关基因的转录，阻止病毒的包装过程；并促进病毒特异性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)清除被病毒感染的细胞，从而增强机体的抗病毒能力；除此之外，在病毒感染时，细胞内的HDAC6可以激活IRF3转录因子，促进β-干扰素基因的表达。研究表明，组蛋白去乙酰化酶6可以调控I型HIV病毒对人类细胞的感染能力(Agustin Valenzuela-Fernandez等，Molecular Biology of the Cell，2005)。

我们所建立的过表达Hdac6基因的转基因小鼠为病毒感染的防御机制的解析提供了新的材料，也将为神经退行性疾病及癌症等疾病的治疗带来新的曙光。除此之外，还为将来大型农业动物的基因改造打下了坚实的理论基础。

发明内容

本发明是一种制备高表达鼠HDAC6且具有高抗病毒感染能力的转基因鼠的方法。

该发明提供的方法是将序列表中序列1 DNA序列导入哺乳动物细胞中，获得高表达鼠HDAC6蛋白的转基因细胞；以所述转基因细胞利用4-8细胞阶段胚胎注射的方法获得转基因胚胎；将所述的转基因胚胎通过手术法移入小鼠子宫内进行妊娠，获得具有生殖系转移的嵌合体转基因后代，通过后代交配产生纯合的转基因小鼠。

其中，所述哺乳动物细胞可以是胚胎干细胞。

所述基因序列及克隆引物、所述转基因细胞和所述克隆胚胎也属于发明的保护范围。

本发明的方法能在转基因鼠体各组织内稳定表达鼠HDAC6并显著提高鼠的抗病毒感染能力和降低病毒感染死亡率。

附图说明

图1为鼠HDAC6载体结构示意图。

图2为鼠HDAC6载体XhoI和NotI双酶切示意图，M：分子量marker(1kb DNA ladder)；1、2、3、4：质粒编号。

图3为由DK26/V6.5ES获得的嵌合体小鼠。

图4转基因鼠尾巴组织中Hdac6基因的转录水平检测。B1、B2、B3、B4、B5、G1、G2、G3、G4分别为毛皮为黑色和灰色的转基因小鼠编号，ICR、C57为对照组小鼠名称。

图5为转基因小鼠的抗病毒感染情况分析。TG为病毒处理组，WT为对照组。与对照相比，在相同的病毒感染的情况下，转基因小鼠的存活时间和存活数量明显高于对照组。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可以从商业途径获得。

引物合成及序列测定由invitrogen(北京公司)完成。

反转录试剂盒和lipo转染试剂购于invitrogen公司。

RNA提取试剂盒购于Qiagen公司。

Pfu DNA扩增酶、克隆载体、胶回收试剂盒购于transgen公司。

表达载体来自于invitrogen公司，但经过改造。

酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等分子生物学实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

限制性内切酶购于Takara公司。