[发明专利]进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种蛋白(包括单抗或类单抗蛋白)生产的高产量反应器，特别是涉及一种进行蛋白生产的全新式高产量反应器及其生产方法和应用。

背景技术

现阶段，国内外生物制药行业使用哺乳动物工程细胞株表达生产单抗或融合蛋白，主要采用大规模的批式流加培养方式。

其中，哺乳动物细胞的批式流加作为常规方法，在研发上需要长时间的工艺摸索与大量的条件验证与重复，在cGMP(Current Good Manufacture Practices)生产上往往需要经过反复验证的、体积巨大的细胞培养设备与复杂的配套系统。即传统的哺乳动物细胞批式流加培养有一些难以克服的缺点，如最高细胞生长密度不高、单批次蛋白表达量偏低、细胞有害代谢产物无法排除、工艺控制复杂等等。

然而，哺乳动物细胞的灌流培养一直是重要的备选技术解决方案，但该技术在控制上的复杂性一直是制约其广泛应用的瓶颈。因此，长时间以来，灌流培养一般只用于不稳定，容易降解或聚合的蛋白产品。

普通的细胞截留方法，液体流动方向与截留膜表面垂直，容易造成截留膜表面沉积大量细胞，容易堵塞并对细胞生长造成不利影响。使用中空纤维柱、采用切向流的方式对细胞进行截留可以有效避免上述情况(如图1所示)。而常规使用的中空纤维柱规格为1mm直径、0.2μm孔径，但在截留了细胞的同时，却无法截留目的蛋白。

因此，目前即使使用ATF灌流设备(美国Refine Technology公司)作为技术模块，在产业化方面仍然存在一些显著问题，比如极高的培养基使用量和细胞偏向于生长而不是蛋白表达等问题，即便使用可抛弃型的生产设备，受限于较低的单批次蛋白产量，仍需付出高额的时间以及资金成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种进行蛋白生产的高产量反应器及其生产方法和应用。本发明通过配合使用ATF灌流设备，采用全程灌流培养或灌流培养与批式流加培养相结合的方式，迅速提高最高细胞生长密度，提高单细胞表达量，进而加快蛋白生产工艺研发进程。

为解决上述技术问题，本发明的进行蛋白(包括：单抗、类单抗蛋白)生产的高产量反应器，包括：生物反应器，与该生物反应器连接的ATF灌流设备；其中，该生物反应器，包括：能与ATF灌流设备对接配合使用的常规生物反应器或可抛弃型生物反应器。

所述生物反应器，包括：2L～25L的小试规模生物反应器，30～1000L的中试及生产规模生物反应器；其中，该生物反应器的组成包括：加液泵，与该加液泵关联控制的液面控制器。

所述ATF灌流设备中的中空纤维柱优选0.2μm孔径的中空纤维柱或截留孔径为50kDa的中空纤维柱。

另外，本发明的利用高产量反应器进行蛋白的生产方法，包括步骤：

(1)将生物反应器与对应型号的ATF灌流设备连接，完成离线灭菌或在位灭菌程序；

(2)使用生长培养基，将种子细胞按照0.3×10⁶～1×10⁶ cells/mL的密度接种生物反应器至工作体积，控制温度、pH、溶解氧浓度、罐压，每24小时取样检测细胞数与生化指标；

其中，该生化指标，包括：pH、O₂溶解分压、CO₂溶解分压、谷氨酰胺含量、谷氨酸含量、葡萄糖含量、乳酸含量、NH₄⁺水平、Na⁺水平、K⁺水平、Ca⁺水平、渗透压等；

(3)当活细胞密度增长至3×10⁶～4×10⁶ cells/mL的密度时，启动ATF设备程序进入灌流培养；

(4)收集生物反应器内或从ATF灌流设备中的中空纤维柱滤出的培养液，纯化，得到所需蛋白产品(包括：单抗及类单抗蛋白)。

所述步骤(2)中，控制温度为36～37℃、pH为pH 6.8～7.2、溶解氧浓度为40％～60％、罐压为2～8psi。

所述步骤(3)中，初期生长培养基交换速率为0.5个培养体积/24小时；其中，灌流培养中：

1)当每24～48小时或活细胞密度倍增一次时，将生长培养基交换速度提高0.5个培养体积/24小时，最高为3个培养体积/24小时，直至最高细胞生长密度达到最高水平；

2)当在培养过程中需要控制最高活细胞生长密度，则在细胞数达标后，维持生长培养基交换速率不变，并降低控制温度为32～35℃；