[发明专利]中国北方大肠癌患者hMLH1基因的新突变及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及中国北方散发大肠癌患者的hMLH1基因的一种新的突变类型。属于分子检测领域。

背景技术

hMLH1基因是大肠癌患者的致病基因之一。自Papadopoulos N等人1993年在Lynch syndrome大肠癌患者中发现了hMLH1基因突变后，国内外大部分文献报道了hMLH1基因在Lynch syndrome大肠癌中的突变位点，只有少部分文献报道了hMLH1基因在散发大肠癌中的突变位点。但hMLH1基因在中国北方散发大肠癌患者中的突变无人报道，尤其是在一例散发大肠癌患者中新发现的突变(c.704GAT＞GTT(p.Asp235Val))在国内外均未见报道。

发明内容

本发明在已报道hMLH1基因突变基础上更丰富了hMLH1基因在大肠癌患者中的突变谱。为大肠癌患者的分子诊断和治疗提供了理论基础。

本发明的发明人在342例散发大肠癌患者中开展了hMLH1基因外显子1-19、hMSH2基因外显子1-16、k-ras基因12和13密码子、Braf基因11、15外显子和PI3K基因9、20外显子的突变筛检，在1例散发大肠癌患者中发现了hMLH1基因外显子9的一种新的突变类型。而该病例未携带其它与散发大肠癌有关的基因突变。

在现有研究的基础上，本发明提出了一种分离的突变hMLH1基因或其片段，其特征在于所述的基因或其片段的cDNA序列是在GeneBank登录号为NM_000249.3所示的序列基础上发生以下突变：c.704GAT＞GTT(p.Asp235Val)。(cDNA碱基位置的命名是从ATG开始)。

所述的突变hMLH1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了一种用于扩增权利要求1或2所述的突变hMLH1基因或其片段的引物。

优选的，所述的引物序列如下所示：

上游F：5’-CAGGAGGACCTCAAATGGACC-3’

下游R：5’-GTTGATGAAGAGTAAGAAGATGC-3’

进一步的，本发明还提供了一种用于检测所述的突变hMLH1基因或其片段的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒中包括以上所述的引物。

优选的，所述的试剂盒中包括的引物序列如下所示：

上游F：5’-CAGGAGGACCTCAAATGGACC-3’

下游R：5’-GTTGATGAAGAGTAAGAAGATGC-3’

更进一步的，本发明提出了所述的引物在制备诊断或检测中国北方大肠癌患者hMLH1基因试剂中的应用。及

所述的试剂盒在制备诊断或检测中国北方大肠癌患者hMLH1基因试剂中的应用。

本发明的是通过以下技术方案实现的：

(1)采用经典的饱和酚氯仿的方法提取组织样本DNA。

(2)设计需要扩增的hMLH1基因外显子9的引物。

(3)配制25μl PCR扩增体系，并进行PCR扩增。

(4)琼脂糖凝胶电泳

配制1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉，加入到1.0×TBE电泳液中。PCR产物在100V的条件下电泳30-40分钟。电泳结束后于紫外灯下观察结果。若在目的片段大小的位置出现条带则PCR成功，可以进行下一步的聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(5)聚丙烯酰胺凝胶电泳

①制备玻璃板架：将两块玻璃板平放，玻璃板之间的三边插入胶条，三周用夹子夹紧，斜放在架子上。

②配制浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶用500ml量筒量取243.8ml双蒸水至1000ml大烧杯中；用100ml和500ml量筒分别量取40ml 10×TBE、192ml 30％聚丙烯酰胺至已加入双蒸水的大烧杯中，分别用移液管和移液器吸取4ml 10％过硫酸胺、200μl TEMED至大烧杯中，用玻璃棒充分搅拌混匀。

③加样：将上述配好的混合液用玻璃棒引流至已经夹好的玻璃板之间，插入梳子。将制好的聚丙烯酰胺胶连带玻璃板夹固定在电泳槽上，倒入约400mL1×TBE。将准备好的电泳槽连接到电泳仪上，300伏预电泳30分钟。将变性buffer与PCR产物按照5∶1的比例至10μl体积混匀离心。98℃变性10分钟，将变性后的PCR产物迅速冰浴。将PCR产物用微量加样器加入上样孔。

④电泳：将电泳槽放入4℃冰箱。300伏电泳5分钟，150伏电泳过夜。