[发明专利]一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用

说明书

技术领域

本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种胃癌细胞的核酸适配体的序列及应用。

背景技术

胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，也是最常见的消化道恶性肿瘤；据统计，胃癌在我国的患病率位居各类肿瘤的第二位，在所有胃的恶性肿瘤中，腺癌占到95％。临床上大多数胃癌病人确诊时往往已经处于晚期，其5年生存率不超过10％，因此早期诊断是提高胃癌生存率的关键，而寻找早期诊断的肿瘤标志物对于胃癌的诊断和治疗则具有十分重要的意义。

目前，已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段，其特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment，SELEX)技术，SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)；相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)，核酸适配体的优势相当明显，例如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰。

核酸适配体的诸多优势令其在基础研究、临床检测、新药开发等方面有着广泛的用途。在临床检测方面，目前能用抗原抗体反应进行检测的技术几乎都可以用核酸适配体替代，如Archemix公司开发的一种适配体分子传感器——RiboReporter^TM即可以将检测到的蛋白信号直接转化成光信号记录并分析，从而实现了对生物混合液(如血清、细胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速检测。在新药开发方面，最典型的例子便是第一个通过美国FDA批准上市的核酸适配体药物Macugen，其为抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)的核酸适配体，被用于治疗湿性老年性黄斑变性(wet AMD)。另一个核酸适配体药物的例子是由Aptamera公司研制的AGR0100。临床前试验表明，AGRO100对多种癌细胞均有抑制作用。

目前国际上大部分从事核酸适配体研究的科学家和生物技术公司主要针对心血管疾病，而较少关注中国人的常见疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等，因此本发明优先考虑核酸适配体应用于上述严重威胁我国人民健康的重大疾病，开发针对胃癌细胞的核酸适配体作为特征性标志物，为胃癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，具有重要的临床价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种胃癌细胞的核酸适配体的序列，尤其涉及一种胃癌细胞株HGC27的核酸适配体中具有特异结合胃癌细胞株HGC27的序列(本发明中命名为HGCAp2)。

本发明中，所述的胃癌细胞的核酸适配体(序列1)中含有特异结合HGC27的特征序列，所述的特征序列为TTGGTT。

本发明中，所述的胃癌细胞选自胃癌细胞株HGC27。

本发明的进一步目的是提供所述核酸适配体序列的用途，根据对该序列分析，设计抗胃癌的药物并进一步制备抗胃癌的药物或制品。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

利用核酸适配体的体外筛选技术即SELEX技术，以胃癌细胞株HGC27(购自上海细胞库)为正筛靶标，以胃粘膜上皮细胞株GES-1(购自上海细胞库)为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库(5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中筛选出与HGC27特异结合的核酸适配体；将筛选出的序列用引物Aptamer_L(5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和Aptamer_R(5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’)进行扩增并进行TA克隆pMD 19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)；挑去白色菌落以引物RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并用M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)为测序引物进行测序反应，上测序仪测序；根据测序结果分析特征序列。