[发明专利]红球菌WB-1及其培养方法和用于降解多氯联苯的方法

权利要求书

1.红球菌（Rhodococcus sp.）WB-1，CGMCC No.5500。

2.根据权利要求1所述的红球菌WB-1, 其特征在于：主要形态特征为：在葡萄糖铵盐培养基中呈短杆状；在LB培养基中呈杆状；成单、成双、成链；大小（0.6μm -1.2μm）×（1.5μm -6.0μm）；菌落特征：圆形，在LB上呈橙色，略干，隆起，老的培养物边缘不规则，最适生长温度为28-30℃，最适生长pH为7.0-7.2，在无机盐培养基中以500-1000mg/L的联苯为唯一碳源生长，能在24h内降解90%以上的1mg/L的2,3-二氯联苯、2,4-二氯联苯、3,4-二氯联苯和2,4,4-三氯联苯，还可以在72h内降解90% 以上的10mg/L的2,4,4-三氯联苯和50%以上的1mg/L的2,2’,3,3’-四氯联苯。

3.红球菌WB-1的培养方法，其特征在于：该方法包括下述顺序的步骤：

1）取受多氯联苯污染的土壤样品2g，加入100ml富集培养基中，该富集培养基的配方为：NaCl 0.5-1.5g/L，NH₄NO₃ 0.5-1.5g/L，K₂HPO₄ 1.0-2.0g/L，KH₂PO₄ 0.3-0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3g/L，酵母提取物0.05-0.2g/L，调pH7.0-7.2后，按500-1000mg/L添加联苯，于28-37℃，120-180rpm摇床培养，得到培养液；

2）上述培养液每1-2周转接移种一次，以5-10％的接种量接入所述的富集培养基中，驯化3-6个月；将最终的培养菌液用平板稀释法进行细菌分离，从中获得生长快、菌落规则的单菌落7个；

3）检测各菌株降解多氯联苯的性能，方法为：将单菌接入LB培养基中培养18-24h后，离心收集菌体，pH7.0-7.2的无菌磷酸缓冲液清洗菌体沉淀，再重复离心、清洗一次，最后用pH7.0-7.2的无菌磷酸缓冲液悬浮菌体，将菌液OD_600nm调节为1.0-2.0，4-8℃保存备用；

4）以5-10%的接种量将菌悬液加入含1-10mg/L2，4，4-三氯联苯的pH7.0-7.2的无菌磷酸缓冲溶液中，3-5d后检测多氯联苯含量，筛选得到降解率最高的菌株（编号为F-1），经生理生化鉴定，确定该菌株属红球菌属（Rhodococcus sp.），命名为WB-1，保存于LB斜面或甘油冻存管中，使用时在含联苯的培养基上进行活化。

4.权利要求1所述的红球菌WB-1用于降解多氯联苯的方法，其特征在于：该方法包括下述顺序的步骤：

a.各种培养基的配制：

LB培养基：2.5-7.5g/LNaCl，2.5-7.5g/L酵母膏，5-15g/L蛋白胨，调pH至6.0-8.0；

无机盐培养基：NaCl 0.5-1.5g/L，NH₄NO₃ 0.5-1.5g/L，K₂HPO₄ 1.0-2.0g/L，KH₂PO₄ 0.3-0.8g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-0.3g/L，酵母提取物0.05-0.2g/L，调pH7.0-7.2；

发酵培养基：葡萄糖5-15g/ L，酵母膏1-2g/ L，(NH₄)₂SO₄1.0-2.0g /L，NaCl 0.5-1g/ L，调pH至6.0-8.0；

b.将红球菌WB-1菌种从LB斜面或甘油冻存管中划线至固体LB平板中，30-35℃活化培养18-24h；

c.将活化后的单菌落接种于LB液体培养基中，30-35℃，120-180rpm摇床培养至对数生长期，将上述培养液离心，用pH7.0-7.2的磷酸缓冲液清洗后，以5-10%接种量加入含500mg/L联苯的基础培养基中，30-35℃，120-180rpm摇床培养，培养3-5d待培养液中联苯颗粒消失后，用显微镜检测培养液中细菌的数量和纯度；

d.在4-8℃，8,000-10,000r/min离心10-15min收集培养液中的菌体，用pH7.0-7.2的无菌磷酸缓冲液清洗菌体沉淀，再重复离心、清洗一次，最后用pH7.0-7.2的无菌磷酸缓冲液悬浮菌体，将菌液OD_600nm调节为1.0-2.0，4-8℃保存备用；

e.以5-10%的接种量将菌悬液加入含1-10mg/L多氯联苯的溶液或污水中，30-35℃，120-180rpm摇床培养，培养3-5d后用GC检测溶液中多氯联苯的含量，以不加菌的含多氯联苯的溶液和污水为对照，得到多氯联苯降解率；

f.将菌悬液加入含多氯联苯的污染土壤中，30-35℃，保持土壤湿度60-80%，处理15-30d后提取检测土壤中的多氯联苯，以没有加菌的土壤作为对照，得到多氯联苯的降解率。