[发明专利]基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物传感器领域，具体涉及一种基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法。

背景技术

凝血酶是一种多功能丝氨酸蛋白酶，在生物体内一系列生理和病理过程中起重要作用。它不但参与止血和凝血、炎症、免疫反应、组织修复和创伤愈合，而且可激活正常细胞的致瘤潜能和导致恶性细胞的转移表型。随着现代社会的发展，人们的物质生活水平不断提高，但随之而来的是各种疾病的侵袭。而这其中有很大一部分是心血管及脑部疾病，由于现在的检测技术有限，使很多可以治愈的疾病失去了最佳治疗期，从而造成不可挽回的后果。新近的研究表明，血凝块产生的凝血酶在这些过程中起着关键作用。从而为脑出血的治疗及研究提供了可能。

参考文献[1]Chunhai Fan，Kevin W.Plaxco，and Alan J.Heeger.Electrochemical interrogation of conformational changes as a reagentless method for the sequence-specific detection of DNA.Applied Biological Sciences，2003，100(16)，9134-9137中记载，Plaxco K.W等人分别利用亚甲蓝标记的2个含碱基数不同的凝血酶适体构建了信号抑制型(信号抑制)和信号放大型(信号增益)的电化学传感器，将亚甲蓝标记的带32个碱基的凝血酶适体通过自组装作用固定在金电极表面。当未加入凝血酶时，适体呈随意的卷曲状态，亚甲蓝离电极的距离近，电子传递能力强，电流信号较大；当加入凝血酶，适体折叠与凝血酶特异性结合形成G-四聚体椅状构象，亚甲蓝离电极表面的距离变远，电子传递能力减弱，电流信号显著降低，即为信号抑制型，检出限为6.4nmol/L。信号抑制型的优点是电极的表面可以更新，缺点是会检测到由于污染引起的假阳性结果。随后，他们又设计了信号增益型：通过巯基自组装作用将27个碱基的适体固定在金电极表面，与另一条部分互补的标记亚甲蓝DNA链杂交(21个碱基)，杂交后，亚甲蓝距离电极表面较远，电子传递能力弱，亚甲蓝的还原电流很小；当加入凝血酶后，凝血酶与适体强烈的结合力使杂交双链部分解离，亚甲蓝离电极表面的距离变近，亚甲蓝的还原电流增大。该法测定的灵敏度为3nmol/L。信号增益型克服了信号抑制型可能会检测到的假阳性结果，提高了检测的灵敏度。

而基于光信号、pH信号、离子信号等的离子通道，也是当今一大热门研究的方向。参考文献[2]Correll B A，Breach L B，King L G，et al.[J].Nature，1997，387：580-583中记载，Correll等人在1997年研制出了一种新型的基于BLM的离子通道开关(ion-channel switch，ICS)生物传感器。该传感器在稳定性、灵敏度、选择性、可靠性等方面均有很大提高，通过改变受体的性质和类型，可用于血型分析，检测细菌、病毒、DNA、药物、抗体及电解质等，但是灵敏度和检测限都远远不能满足现有技术发展的需求。

发明内容

本发明的目的是结合离子通道和传统的电极上的基于适配体生物传感器，使得适配体在电极上的修饰成为三维立体，脱离传统的二维平面的修饰。另外借助离子通道的开关概念，使得检测具有仿生和智能的性质。制备出机理为信号增益的检测凝血酶的生物传感器，达到信号放大的效果。本发明可以达到很低的检测限(1pM)和非常好的选择性，在实际样品中也有很好的应用。

本发明提供的基于离子通道和适配体制备生物传感器检测凝血酶的方法，具体步骤如下：

第一步：离子通道的制备：将刻蚀液9M NaOH溶液滴在PET膜一面上，在35摄氏度的温度下，进行刻蚀。通过控制时间的长短可控制离子通道孔径的大小。通常刻蚀30分钟，此时的孔径用电子显微镜测试后，约150nm～200nm。刻蚀完毕后，浸泡在1M HCOOH阻止溶液中30分钟。洗净放入去离子水中待用。

第二步：DNA适配体的配置与准备：在PBS(phosphate buffer solution)缓冲溶液中加入DNA适配体，形成DNA适配体溶液，DNA适配体溶液放置在90摄氏度水浴下5分钟，然后自然冷却到常温。使用前放置在-20摄氏度条件下保存。

第三步：P-ATP(对巯基苯胺)的配置：以无水乙醇为溶剂，向溶剂中加入P-ATP，得到含有10mM的P-ATP的乙醇溶液，该乙醇溶液在使用前配置，密封保存，以免液体挥发。