[发明专利]垃圾堆肥中苏云金芽孢杆菌菌落的测定方法

说明书

技术领域

本发明属于环境保护技术领域，涉及一种垃圾堆肥中苏云金芽孢杆菌菌落的测定方法。

背景技术

堆肥化（Composting）是指在有控制的条件下，使有机废弃物在微生物（主要为细菌）作用下，发生降解，并同时使有机物向稳定的腐殖质方向转化的过程。堆肥化后的产物称之为堆肥（Compost）。堆肥过程可以将混合物的体积有效地减少40%-50%，并且可以依靠在高温阶段中代谢产生的热量杀死垃圾中的病原物质。堆肥不是一项新的技术，但用这种方法处理城市固体垃圾，符合环境的利益，因为在堆肥过程中清除或者减少了城市固体垃圾中的毒性并使得最终的产物可以被用来进行再利用。堆肥的程序包括原料的预处理、原料发酵和后处理，堆肥过程受水分、氧含量、C/N比、温度、pH和通风情况等因素的影响。

堆肥化过程的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，在堆肥化过程中，生活垃圾中的可溶解有机物质透过微生物的细胞壁和细胞膜而被微生物所吸收，而微生物通过自身的生命活动过程，把吸收的有机物转化成无机物。微生物在堆肥过程中扮演着重要角色，与堆肥周期和堆肥质量密切相关。因此，堆肥中微生物的研究对开发堆肥微生物资源，加速堆肥过程，减短堆肥周期，提高堆肥质量都具有重要的意义。

微生物种类繁多，自然界中仅有极少数的微生物得到鉴定，能够存活、培养的种类更是少之又少，至多为微生物总量的l%。目前，国内外对于堆肥中的微生物进行了一系列理论和实践的研究。但是堆肥中存在着非常复杂的微生物体系，整个堆肥过程中的微生物结构的变化和演替也非常巨大，采用传统的分离培养和生理生化实验方法和手段难以完全认识，但随着研究手段的改善和研究方法的创新，分子生物学方法、杂交技术、PCR和DNA指纹等新技术的应用，为堆肥微生物学的研究提供了新的途径。运用分子生物学技术和研究手段，可以直接对堆肥微生物的总DNA进行研究，突破了菌株分离和培养的限制，能够动态地研究微生物的群落多样性，有利于更加深入的了解堆肥中的微生物群落，并可能发现新的微生物物种。

苏云金芽孢杆菌是目前国际上生产量最大并成功地用于防治农、林、贮粮害虫和一些卫生害虫的微生物杀虫剂，苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的同时，可以形成一种由杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体，它的主要杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白。研究发现，这种蛋白对多种农林害虫具有特异性杀伤作用。昆虫取食芽孢晶体混合物后，晶体在昆虫体内的中肠碱性环境和蛋白酶的作用下被降解形成杀虫活性蛋白，研究结果表明这些毒蛋白单独作用或不同蛋白间协同作用对昆虫具有不同程度的毒杀作用，进一步加强苏云金芽孢杆菌在防治和控制害虫危害方面的研究，对于保护人类生存环境实现可持续发展具有重大意义。

    近几年来，由于化学制剂引起的环境问题日益严重，以及人们环保意识的日益增强，利用微生物制剂作为化学农药的补充或替代品来促进植物生长、防治植物病害，已经成为当前生防制剂开发的重点并引起人们的高度重视。研究发现，垃圾堆肥中微生物种类丰富、数量庞大，生长活跃，具有广泛的应用价值，将堆肥中部分微生物提取出来制成复合菌剂对草坪植物生长、矿质营养吸收均有显著地提高。本研究从堆肥悬浊液中取出部分悬浊液，在适合不同的菌株生长的固体培养基上培养分离，分离后的菌株分别进行纯化培养，从而将堆肥中有利于增强植物抗逆性的有益菌种进行鉴定。

发明内容

 

本发明采用的苏云金芽孢杆菌（拉丁名：Bacillus thuringiensis）菌种保藏号:CFCC10206,保藏单位：中国林业微生物菌种保藏管理中心，对外可以提供。

生理生化特性：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为1.0-1.2×3-5μm。形成半孢晶体，对阿拉伯糖甘露醇不产酸产淀粉酶，硝酸盐还原到亚硝酸盐。

苏云金芽孢杆菌毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD₅₀ 852.7-856.7毫克/公斤，对家禽、鸟类、鱼、畜等低毒。

本发明公开了一种垃圾堆肥中苏云金芽孢杆菌菌落的测定方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0^-1浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0^-2、l0^-3、l0^-4、l0^-5、l0^-6几种浓度的堆肥稀释液；