[发明专利]一种狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法，即以表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞作为抗原和载体颗粒，通过与人、犬和猫的血清抗体进行凝集反应，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗体是否达到免疫保护水平；属于生物工程技术领域。

背景技术

狂犬病是由狂犬病病毒感染引起的一种致死性传染病，一旦发病即导致100%死亡。防止狂犬病发生的根本手段是对动物进行暴露前预防免疫或对人进行暴露后紧急治疗。两种方法都是通过注射疫苗，使接种动物或人产生足够水平的中和抗体，从而阻止病毒感染的发生。免疫动物或人体内狂犬病病毒中和抗体达到0.5IU/mL以上，既可有效防止狂犬病病毒的感染，中和抗体水平越高，其维持免疫保护的时间越长，因此，定量监测血清内中和抗体滴度，对于判断免疫效果和免疫持续期具有重要的意义。

用于测定狂犬病病毒中和抗体的方法包括小鼠脑内中和试验、蚀斑抑制试验、快速荧光灶抑制试验（RFFIT）和荧光抗体病毒中和试验（FAVN）等，其中RFFIT法和FAVN法分别是WHO和OIE推荐的标准方法。但是，这些检测方法所需时间较长（一般在48h以上），操作复杂（需要使用活病毒和动物、细胞），而且检测成本高。

为了改进这些方法，不同的实验室和研究人员分别建立了酶联免疫吸附试验、荧光标记抗体检测和乳胶凝集试验等方法，但这些技术均以病毒颗粒或纯化蛋白作为抗原，存在检测抗体针对性不强或成本高的缺点。

发明内容

本发明涉及一种狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法，解决了传统测定狂犬病病毒中和抗体的方法时间长、操作复杂、检测成本高等问题。

本发明公开的狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法，采用以下技术解决方案：

以表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞作为抗原和载体颗粒，通过与血清抗体进行凝集反应，可判定血清中所含狂犬病病毒中和抗体是否达到免疫保护水平。基本方案：以携带狂犬病病毒糖蛋白基因的pIRES-neo真核表达载体分别转染人胚肾细胞293、犬肾细胞MDCK和猫肾细胞F81，通过G418筛选，分别获得稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞系。然后，将该细胞系在1%多聚甲醛中固定后，取其产物分别与人、犬和猫的待检血清进行反应，当血清中狂犬病病毒中和抗体水平达到免疫保护水平时，会出现明显的凝集现象，否则不凝集。

本发明的狂犬病病毒中和抗体细胞凝集试验检测方法的建立：

1. 狂犬病病毒糖蛋白基因表达载体的构建

　　利用商品化的真核表达质粒载体pIRES-neo（CLONTECH公司产品），通过常规的分子克隆技术构建表达狂犬病病毒糖蛋白基因（GenBank：AF499686.2）的载体pIRES-neo/G。

2. 稳定表达细胞系的建立

　　在转染试剂（脂质体等）的介导下，将构建的真核表达载体pIRES-neo/G分别转染至人胚肾细胞293、犬肾细胞MDCK和猫肾细胞F81中，通过G418筛选，获得稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的细胞系。

3. 抗原与载体颗粒的制备

将该细胞系用PBS（pH7.4）洗涤3次后，加入等体积的1%多聚甲醛固定后，2000rpm离心3min，细胞沉淀用等体积PBS（pH7.4）重悬，即获得携带抗原的载体颗粒。

4. 细胞凝集试验

取携带抗原的载体颗粒，分别与稀释后的人、犬和猫待检血清等体积混合后，37℃反应15min，当血清中狂犬病病毒中和抗体水平达到免疫保护水平时，会出现明显的凝集现象，否则不凝集。

发明的积极效果在于：采用真核传代细胞建立了一种凝集试验方法，可用于检测狂犬病病毒中和抗体水平，在制备和检测程序上，均不同于目前广泛使用的红细胞凝集试验和乳胶凝集试验。