[发明专利]一种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺

权利要求书

1.一种含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，其特征是：该方法步骤如下：

(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种经稀释的禽流感工作种子批毒种，置33～35℃培养48～72小时；

(2)、病毒收获：筛选活鸡胚，置2～8℃一定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后逐容器取样进行尿囊收获液检定；

(3)、病毒灭活：病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200μg/ml的甲醛，置2-8℃灭活15～24小时，灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；

(4)病毒收获液浓缩：灭活后的收获液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；

(5)、病毒纯化：

(5.1)蔗糖速率区带离心：在静止时以不超过离心腔容积50％的量泵入50～60％的蔗糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min～40000r/min，连续泵入病毒液，进样完毕，泵入缓冲液后，调节转速至0r/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；

(5.2)柱层析：用Sephrose-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L的PBS，pH7.2，上样及洗脱线性流速为5～6mm/min，检测波长为280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；

(6)、病毒裂解：纯化后的病毒液加入终浓度为0.3～0.5％Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟，然后梯度离心2小时，在280nm波长监测下收集第一峰；

(7)、除糖除裂解剂：将离心后的裂解物用无菌0.01M pH7.2PBS溶液进行超滤浓缩，以去除蔗糖并进一步去除裂解剂，最终浓缩至合适液量，取样检测细菌内毒素含量和微生物限度，控制细菌内毒素不高于50EU/ml，微生物限度检测要求不高于10cfu/ml；

(8)、除菌过滤：纯化后的裂解物经0.22μm孔径的滤膜过滤即为单价原液，单价原液应置于2-8℃保存。

2.根据权利要求1所述的含MF59佐剂禽流感病毒裂解疫苗的制备工艺，其特征是：半成品配制：根据所配制的半成品总量计算原液用量，使血凝素含量为30μg/ml，按50％的量加入MF59佐剂，再加入Buffer溶液，混匀后经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。