[发明专利]一种简单快速同步检测三种水稻病毒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物保护技术领域，尤其是一种简单快速同步检测三种水稻病毒的方法。

背景技术

近年来，上世纪60年代初在江浙一带发现的水稻条纹病毒(rice stripe virus，RSV)和水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)又在我国多个水稻种植区流行，仅2004-2005年间水稻条纹病毒在江苏省的发病面积就在2000万亩以上。南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus，SRBSDV)，又名水稻黑条矮缩病毒2号(Rice black-streaked dwarf virus 2，RBSDV-2)，是最近新发现的一种重要的水稻病毒，自2001年在广东阳江市报道以来，2010年已在越南北部和我国华南、华中、华东等14个省市自治区发生，发病面积达2000万亩以上。以上3种重要的水稻病毒均由昆虫以持续性方式传播，且在田间均可感染水稻、玉米、高梁、稗草等一些常见的禾本科作物和杂草。其中，由灰飞虱传播的水稻条纹病毒、水稻黑条矮缩病毒分属于纤细病毒属(genus Tenuivirus)和呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(genus Fijivirus)，由白背飞虱传播的南方水稻黑条矮缩病毒是呼肠孤病毒科斐济病毒属第二组一个暂定的新成员。从寄主范围、流行特点、地理分布等流行学来看，这3种水稻病毒病在我国都曾大面积流行并造成了水稻等作物产量的严重损失，近年来虽病情指数有所不同但都常年发生且发生地域存在一定的重叠，尤其在我国华东地区，这给该类病害的诊断、预测预报和防控带来了一定的困难，也对病害的检测提出了更高的技术要求。血清学方法是常用的快速廉价的检测方法之一，但由于RBSDV与SRBSDV之间存在强烈的血清学交叉反应，目前所制备的多克隆抗体尚不能用来区分这2种病毒。大量RSV、RBSDV、SRBSDV基因组全序列相继测定及其登录和公开促进了这些病毒的分子检测方法的建立，华南农大周国辉等]和湖南农大周倩等根据S10序列分别发展了巢式和一步RT-PCR方法用于特异性地检测SRBSDV，江苏农科院季英华等根据序列差异较多的S9序列发展了检测RBSDV和SRBSDV的方法。日本学者Le et al.采用环介导的等温扩增技术建立了9种水稻病毒的检测方法，但这些方法均不能用来同时检测这3种病毒。

发明内容

本发明要解决上述现有技术的缺点，提供一种快速、准确、灵敏且同步检测这3种重要水稻病毒的方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种简单快速同步检测三种水稻病毒的方法，应用一套病毒特异性引物以待测样品总RNA为模板进行一步RT-PCR扩增，该引物共有6条，它们的基因序列表示如下：

DRS-1，5’-CACTCTAGCTGATTTGCAGAAGGCA-3’；

DRS-2，5’-GGTCTTCACTTTCCCATTGGTGATG-3；

DRB-1，5’-ACTAAGCTTATTTGCTACCTCCAAAC-3’；

DRB-2，5’-ATTAGTRCGCAAMGTGGACAAACTG-3’(R＝A，G；M＝A，C)；

DSR-1，5’-CGCTTTAGATGCTGACAAATCACTTTTA-3’；

DSR-2，5’-CTCCTTTTCTAAGTGCAGACAGTCC-3’。

最后通过凝胶电泳条带以判断水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)、水稻条纹病毒(RSV)以及南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)的侵染状况，其具体包括以下步骤：

1)引物设计：通过分析GenBank数据库公布和本实验室测定的水稻黑条矮缩病毒、水稻条纹病毒以及南方水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白的基因，获得3种病毒种内保守种间呈多态性的区域，并应用Primer6.0程序设计针对3种水稻病毒的6条特异性引物，这些引物在上海生工生物工程服务有限公司合成；